Иммуномодуляторные метаболиты являются основной характеристикой туморной микросреды (ТМЕ), но некоторые исключения, их идентичности остаются не известными. Абраҟа, ҳара анализ ҟаҳҵеит иҳараку аҩаӡара змоу асерозтә карцинома (HGSC) змоу ачымазцәа рышәрақәеи асцитқәеи рҟынтәи ашәрақәеи Т-хәыцрақәеи, абарҭ еиуеиԥшым ТМЕ-компартментқәа рметаболома аарԥшразы. Асцитқәеи ашәратә хәыцқәеи рметаболитқәа реиԥшымзаара дуқәа рымоуп. Асцит иаҿырԥшны, ашәра зҭало Т-хәыцқәа 1-метилникотинамид (МНА) ала еиҳа ибеиоуп. Т-хәыцрақәа рҿы МНК аҩаӡара шҳаракугьы, никотинамид N-метилтрансфераза (S-аденозилметионин аҟынтәи никотинамид ахь аметилтә гәыԥқәа рыиагара катализ азызуа анзим) аҟазаара афибробластқәеи ашәратә хәыцрақәеи рҿы мацара ауп иахьыҟоу. Функционалла, МНА Т-хәыцқәа ашәыра зырҿио ацитокин ашәыра анекрозтә фактор алфа ҭрыжьуеит. Убри аҟнытә, ТМЕ-иалҵыз МНА Т-хәыцқәа риммунтә еиҿкаараҿы ацхыраара ҟанаҵоит, насгьы ауаҩы иканцер ахәышәтәраҿы иммунотерапиатә хықәкыс иҟоуп.
Ашәра иалҵыз аметаболитқәа ашәраҿагыларатә иммунитет ӷәӷәала иаԥырхагахоит, насгьы еиҳа-еиҳа ашьақәырӷәӷәарақәа иаадырԥшуеит урҭ ачымазара аизырҳараҿы ихадоу амчны ишыҟоу (1). Варбургтәи аэффект адагьы, аҵыхәтәантәи аусура иалагеит ашәыра ахәыцқәа рметаболизмтә ҭагылазаашьеи уи ашәыра микроеилазаара (ТМЕ) иммунтә ҭагылазаашьеи ирыбжьоу аизыҟазаашьеи рхарактеристика аҭара. Аҳәынаԥқәа рмодельқәеи ауаҩытәыҩсатә Т-хәыцрақәеи рҿы имҩаԥгаз аҵарақәа иаадырԥшит аглутаминтә метаболизм (2), аксидативтә метаболизм (3), агликозатә метаболизм (4) еиуеиԥшым иммунтә хәыцрақәа ргәыԥхәҭақәа рҿы еиҟәыҭханы аус шыруа. Абарҭ амҩақәа рҿы иҟоу аметаболитқәа жәпакы Т-хәыцқәа рҿагыларатә функциа ааныркылоит. Ишьақәырӷәӷәоуп акоензим тетрагидробиоптерин (BH4) аблокада Т-хәыцқәа рылаҵәара иаԥырхагахар шалшо, насгьы BH4 ацәеижь аҿы аизырҳара CD4 CD8 рыла еиҿкаау ашәраҿагыларатә иммунтә ҭакԥхықәра арӷәӷәара шалшо. Уи адагьы, кинуренин иммуносупрессивтә еффект BH4 ахархәарала еиқәырхатәуп (5). Изоцитратдегидрогеназа (IDH) амутанттә глиобластома аҿы енантиометаболизмтә (R)-2-гидроксиглутарат (R-2-HG) асекрециа Т-хәыцқәа рылаҵара, рылаҵәара, ацитолизтә усура ааннакылоит (6). Аҵыхәтәантәи аамҭазы иаарԥшуп, агликолиз иаҵанакуа аалыҵ метилглиоксал, амиелоидтә хылҵшьҭра змоу супрессортә хәыцрақәа рыла ишыҟаҵоу, насгьы метилглиоксал Т-хәыцрақәа рыла аиагара еффектор Т-хәыцрақәа рфункциа аанкылара шалшо. Ахәышәтәраҿы, метилглиоксал анеутрализациа амиелоидтә супрессортә хәыцрақәа (МДСК) русура аиааира алшоит, насгьы синергиала агәынаҳәа амодельқәа рҿы агәаҭаратә пунктқәа рыблокадатә терапии еиӷьнатәуеит (7). Абарҭ аҵарақәа зегьы еизакны иазгәарҭоит ТМЕ-иалҵыз аметаболитқәа Т-хәыцқәа рфункциеи русуреи рҭышәынтәалараҿы ихадоу ароль.
Т-хәыцрақәа рдисфункциа аовариантә канцер аҿы ирацәаны адырра ҟаҵоуп (8). Ари зыхҟьо хәҭак ала агипоксиеи анормалтәым ашәратә шьаҭақәеи ирыҵоу аметаболизмтә ҟазшьақәа роуп (9), уи иахҟьаны агликозеи атриптофани алактиктә ашьақари акинуренини реиԥш иҟоу аалыҵқәа рахь ииасуеит. Мыцхәы ацеллулартә лактат интерферон-γ (IFN-γ) аҟаҵара еиҵнахуеит, насгьы амиелосупрессивтә гәыԥхәыҷқәа рыдифференциациа ацхраауеит (10, 11). Атриптофан ахархәара ииашаҵәҟьаны Т-хәыцрақәа рылаҵәара ааннакылоит, насгьы Т-хәыцрақәа рыдкыларҭақәа рсигнал аиҭара ааннакылоит (12-14). Абарҭ ахылаԥшрақәа рыдагьы, иммунитеттә метаболизм иазку аусқәа рацәаны имҩаԥган in vitro Т-хәыцрақәа ркультураҿы, еиӷьтәыз амедиа рхы иархәаны, мамзаргьы in vivo еиԥшу аҳәынаԥқәа рмодельқәа рыла иԥкны, урҭ рахьтә аӡәгьы ауаҩы иканцерқәеи афизиологиатә макро-микро-ҳәаақәеи рхетерогенра инагӡаны иаанарԥшӡом.
Акәтаӷьцәа рканцер еицырзеиԥшу ҟазшьоуп аперитониалтә ҭбаара, насгьы асцит ацәырҵра. Асцит аҿы ахәҭатә ӡы аизгара ачымазареи апрогнози бааԥси ирыдҳәалоуп (15). Аҳасабырбақәа рыла, ари зыда ԥсыхәа ыҟам акомпартмент гипоксиа амоуп, ашьаҭанкылатә ендотелиалтә аизҳаратә фактор (VEGF) индолеамин 2,3-диоксигеназа (IDO) рыҩаӡара ҳаракуп, насгьы Т-регулятортә хәыцрақәеи амиелоидтә ингибитортә хәыцрақәеи рыла иҭалоит (15-18). Асцит аметаболизмтә ҭагылазаашьа ашәыра ахаҭа аметаболизмтә ҭагылазаашьа иеиԥшымзар ауеит, убри аҟынтә аперитониалтә ҭыԥ аҿы Т-хәыцқәа ррепрограмма еилкаам. Уи адагьы, асцитқәеи аметаболитқәеи рыбжьара иҟоу аиԥшымрақәеи ахетерогенрақәеи аиммунтә хәыцқәа рыҩналара, насгьы урҭ ахәаҷа-маҷа рҿы русура ԥырхагас иҟарҵар рылшоит, убри аҟнытә иҵегьы аҭҵаарақәа рымҩаԥгара аҭахуп.
Абарҭ азҵаарақәа рыӡбаразы, ҳара еиуеиԥшым ахәҭақәа рыхкқәа (CD4 + CD8 + Т-хәыцқәа уахь иналаҵаны) рыҭҵааразы, иара убасгьы ашәра аҩнуҵҟеи рыбжьараи, иара убасгьы ашәра рыҩнуҵҟеи рыбжьареи рыҭҵаара азы еиҳа ичувствительны ахәҭақәа реиҟәыҭхара, насгьы аӡытә хроматографиа тандемтә массатә спектрометриа (LC-MS/MS) аметод еиқәҳаршәеит. Ҳара ари аметод ҳхы иаҳархәоит иҳараку ацәқәырԥаратә цитометриеи, хәыцктәи РНК-секвенциеи (scRNA-seq) еицны, абарҭ ихадоу апопуляциақәа рметаболизмтә статус ӷәӷәала иӡбаны апортрет аиуразы. Ари амҩақәҵара иаанарԥшит 1-метилникотинамид (МНК) аҩаӡара ӷәӷәала ишеизҳаз ашәыра Т-хәыцрақәа рҿы, насгьы in vitro аԥышәарақәа иаадырԥшит МНК Т-хәыцрақәа рфункциаҿы иммуномодулятортә еффект уаанӡа ишырзымдыруаз. Азеиԥш ҳәаақәа ирҭагӡаны, ари аметод ашәрақәеи аиммунтә хәыцқәеи рыбжьара аҩганктәи аметаболизмтә еидҳәаларақәа аанарԥшуеит, насгьы иммунтә еиҿкааратә метаболитқәа рзы еиуеиԥшым адыррақәа анаҭоит, урҭ Т-хәыцқәа рҟны иҟоу акәтаӷьцәа рканцер иммунотерапиа ахәышәтәраҿы ихәарҭахар алшоит.
Ҳара ҳхы иаҳархәеит иҳараку-дименсионалтә еисратә цитометриа агликоза агара еицырзеиԥшу аамҭазы [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-деоксиглиукоза (2-NBDG) и амитохондриальная активность [MitoTracker Deep Red, DR,DR01 by] типтәи маркерқәа, иммунтә хәыцқәеи ашәратә хәыцқәа рпопуляциақәеи злеиԥшым (Таблица S2 и Асахьа S1A). Абри анализ иаанарԥшит Т-хәыцрақәа ирыҿырԥшны, асцитқәеи ашәратә хәыцқәеи агликоза рыдкылара еиҳа ишырацәоу, аха амитохондриалтә усураҿы аиԥшымрақәа шмаҷу. Ибжьаратәны агликоза агара ашәратә хәыцрақәа [CD45-EpCAM (EpCAM)+] хынтә-ԥшьынтә еиҳауп Т-хәыцрақәа раасҭа, CD4 + Т-хәыцрақәа рыбжьара агликоза агара 1.2 еиҳаны CD8 + Т-хәыцрақәа рҟынтәи, уи иаанарԥшуеит Ашәра инфильтрациатә лимфоцитқәа рҿы (ТИЛ) еиуеиԥшым аметаболизмтә ҭахрақәа рымоуп). Уи иеиԥшымкәа, аҳәынҵәа ахәыцрақәа рҿы амитохондриалтә усура CD4 + T ахәыцрақәа рҿы еиԥшуп, насгьы аҩ-хәыцрак рмитохондриалтә усура CD8 + T ахәыцрақәа раасҭа еиҳауп (Асахьа 1В). Азеиԥш ҳәаақәа ирҭагӡаны, абарҭ аҭакқәа аметаболизм аҩаӡара аадырԥшуеит. Ашәратә хәыцрақәа рметаболизмтә усура CD4 + T хәыцрақәа раасҭа еиҳауп, CD4 + T хәыцрақәа рметаболизмтә усура CD8 + T хәыцрақәа раасҭа еиҳауп. Ахәыцрақәа рыхкқәа зегьы рҿы абарҭ аҟазшьақәа шыҟоугьы, CD4 + CD8 + Т-хәыцрақәа рметаболизмтә статус аҿы, мамзаргьы асцит аҿы урҭ ррелативтә пропорциақәа рҿы еиԥшымзаарак ыҟам, ашәра 1С еиҿырԥшны (Асахьа 1С). Уи иеиԥшымкәа, CD45-хәыцратә фракциаҿы, асцит иаҿырԥшны, ашәраҿы EpCAM+ ахәыцрақәа рыхәҭаа еизҳаит (Асахьа 1D). Ҳара иара убас иаҳбеит еилыкка иҟоу аметаболизмтә еиԥшымзаара EpCAM+ еиԥш EpCAM- ахәҭақәа рыбжьара. EpCAM+ (тумор) ахәыцрақәа рҿы агликоза агара еиҳа иҳаракуп, насгьы амитохондриалтә усура еиҳа иҳаракуп EpCAM- ахәыцрақәа раасҭа, уи ТМЕ аҿы ашәратә хәыцрақәа рҿы иҟоу афибробластқәа рметаболизмтә усура аасҭа акырӡа еиҳауп (Асахьа 1, Е, F).
(А и Б) Амедиантә флуоресценциатә интенсивра (МФИ) агликоза агара (2-NBDG) (А) CD4 + Т-хәыцқәа рмитохондриалтә усура (MitoTracker dark red) (Б) Ахаҭарнакратә графикқәа (арӷьарахь) насгьы таблицатә данноқәа (Арӷьарахь), CD8 + Т-хәыцқәеи EpCAM + T-хәыцқәеи tumorsci a. (С) CD4 + CD8 + ацәеижьқәа реизыҟазаашьа (CD3 + T ацәеижьқәа) асцитқәеи ашәрақәеи рҿы. (D) Асцит и ашәра (CD45−) рҿы EpCAM + ашәра ахәыцқәа рыхәҭаа. (Е и F) EpCAM + CD45-тумор и EpCAM-CD45-матрица агликоза агара (2-NBDG) (Е) и амитохондриальная активность (MitoTracker dark red) (F) репрезентативные графики (слева) и таблицированные данные ( Правый) Асцит и клетки тумор. (G) CD25, CD137, PD1 рцәырҵра ацитометриа ала рхаҭарнакратә графикқәа. (H и I) CD25, CD137 и PD1 CD4 + Т-клетки (H) и CD8 + Т-клетки (I) рҿы рҽырбара. (J и K) Наивная, центральная память (Tcm), еффекторная (Teff) и еффекторная память (Tem) фенотипы, основанные на выражении CCR7 и CD45RO. Асцитқәеи ашәрақәеи рҿы CD4 + Т-хәыцқәа (J) CD8 + T-хәыцқәа (K) рхаҭарнакратә сахьақәа (арӷьарахь) рҭаӡҩыратә дыррақәа (арӷьарахь). Р ахәқәа ҩыџьаратәи t-тест ала иалкаауп (*Р<0.05, **Р<0.01 и ***Р<0.001). Ацәаҳәа иаанарԥшуеит еиқәшәо ​​ачымазцәа (n = 6). FMO, афлуоресценциа минус акы; МФИ, амедиантә флуоресценциа аинтенсивра.
Анаҩстәи анализқәа иаадырԥшит даҽа ҵакы змоу аиԥшымрақәа ӷәӷәала иӡбау Т-хәыцрақәа рфенотиптә статус рыбжьара. Активациа зызу (Асахьа 1, G инаркны I рҟынӡа) насгьы еффектортә гәынкылара (Асахьа 1, J и K) ашәраҿы еиҳа лассы-лассы иуԥылоит асцит (CD3 + T хәыцрақәа рыхәҭаа) аасҭа. Убасҵәҟьа, анализ фенотип активациатә маркерқәа рыла (CD25 и CD137) насгьы аԥсыҽхара маркерқәа [программатә хәыцрақәа рыԥсра апротеин 1 (PD1)] иаанарԥшит, абарҭ апопуляциақәа рметаболизмтә ҟазшьақәа еиԥшымзаргьы (Асахьа S1, В инаркны Е) , Аха ҵакы змоу аметаболизмтә еиԥшымзаарақәа ыҟамызт namemory or асахьа S1 рыбжьара, F инаркны I рҟынӡа). Абарҭ аҵыхәтәақәа шьақәдырӷәӷәеит амашьынатә ҵара аметодқәа рыла автоматла ахәҭақәа рфенотипқәа рыҭара (21), уи еиҳагьы иаанарԥшит ачымаза иасцит аҿы хыԥхьаӡара рацәала абаҩхәҵәы ахәҭақәа (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) шыҟоу (Асахьа S2A ). Иалкааз ахәҭақәа зегьы рҟынтәи, ари амиелоидтә хәҭақәа рпопуляциа еиҳа ирацәаны агликоза агареи амитохондриалтә усуреи аанарԥшит (Асахьа S2, B инаркны G рҟынӡа). Абарҭ аҭҵаарақәа иаадырԥшуеит асцитқәеи ашәрақәеи рҿы иҟоу еиуеиԥшым ахәҭа хкқәа рыбжьара иҟоу аметаболизмтә еиԥшымзаарақәа.
ТИЛ аметабономтә ҟазшьақәа реилкаараҿы ихадоу азҵаара – иахәҭоу ацқьареи, ахаҭабзиареи, ахаҭәаареи змоу Т-хәыцрақәа рҿырԥштәқәа ашәра рҟынтәи рыхгара ауп. Иахьатәи аҭҵаарақәа иаадырԥшит, ацәырҵратә цитометриа шьаҭас измоу аилыхреи ахәаӡқәа рбеиареи рметодқәа ацеллулартә метаболитқәа рыпрофильқәа рҿы аԥсахрақәа рзаанагар шалшо (22-24). Ари апроблема аиааиразы, ҳара LC-MS/MS ала анализ ҟаҵахаанӡа, хирургиала иҭырхыз ауаҩытәыҩсатә анаҩстәи аканцер аҟынтәи ТИЛ аиҟәыҭхаразы, аиҟәыҭхаразы ахәаӡқәа рбеиара аметод оптимизациа азаҳҭеит (иахәаԥш Аматериалқәеи аметодқәеи; Асахьа 2А). Ари апротокол аметаболитқәа рыԥсахрақәа ирымоу анырра иааизакны ахәшьара аҭаразы, ҳара еиҿҳарԥшит хыхь зыӡбахә ҳәаз ахәаӡқәа реиҟәыҭхара ашьҭахь агәабзиара змоу адонорцәа рыла иҟарҵаз Т-хәыцқәа рметаболиттә профильқәа ахәаӡқәа реиҟәыҭхара змам, аха аҵааҿы иаанхаз ахәҭақәа рыла. Абри ахаҭабзиара ахылаԥшра анализ иаанарԥшит абарҭ аҩ-ҭагылазаашьак рыбжьара акоррелиациа ҳарак шыҟоу (r = 0.77), насгьы 86 метаболитқәа ргәыԥ атехникатә еиҭаҳәара аиҭаҟаҵара шҳараку (Асахьа 2В). Убри аҟнытә, абарҭ аметодқәа ирылшоит ииашоу аметаболит анализ амҩаԥгара ахәыцқәа рыхкы абеиара иахысуа ахәыцқәа рҿы, убас ала раԥхьатәи арезолиуциа ҳарак змоу аплатформа аиқәыршәара HGSC аҿы иҷыдоу аметаболитқәа ралкааразы, убас ала ауаа ирылнаршоит ахәыцқәа рҷыдарақәа иҵауланы реилкаара Асексуалтә метаболизм апрограмма.
(А) Амагниттә хәаӡқәа рбеиара асхематә диаграмма. LC-MS/MS ала анализ ҟаҵахаанӡа, ахәыцқәа х-раундк еишьҭагыланы амагниттә хәырпыжәқәа рыла рбеиара иахысуеит, мамзаргьы аҵаа иқәхоит. (Б) Абеиара ахкы аметаболитқәа рырацәараҿы иамоу аҭагылазаашьа. Абеиара хкыцыԥхьаӡа х-шәагак рыбжьаратәи ашәагаа ± SE. Ацәаҳәа ҟаԥшь 1:1 аизыҟазаашьа аанарԥшуеит. Аҵәҩантә дыргаҿы иарбоу еиҭаҟаҵоу ашәарақәа рыкласс аҩнуҵҟатәи акоррелиациа (ICC). НАД, никотинамид аденин динуклеотид. (С) Ачымазаҩ иметаболит анализ аусуратә еишьҭагыла асхематә диаграмма. Асцит мамзаргьы ашәра ачымазаҩцәа рҟынтә еизганы криопресервациа рзыҟарҵоит. Аҿырԥштәқәа зегьы рыхәҭак анализ азуын ацәырҵратә цитометриала, иаанхаз аҿырԥштәқәа CD4+, CD8+, CD45- ацәеижьқәа рзы х-раундк рыла абеиара мҩаԥган. Ари ахәҭақәа рыхәҭақәа LC-MS/MS ахархәарала анализ рзуын. (D) Астандартизациа зызу аметаболитқәа рырацәара аԥхаратә карта. Адендрограмма иаанарԥшуеит Уорд иеилаҵара Евклидовтәи абжьаӡарақәа аҿырԥштәқәа рыбжьара. (Е) Аметаболиттә карта аҿырԥштәы ахәҭа хадақәа ранализ (ПКА), ҿырԥштәыцыԥхьаӡа х-репликак аазырԥшуа, ачымаза иҟынтәи аҿырԥштәқәа цәаҳәала еидҳәалоуп. (F) ПКА аметаболиттә профиль аҿырԥштәы ачымаза иҭагылазаашьа (иаҳҳәап, ахәҭактәи аредунданциа ахархәарала); ацәырҵра ахкы ԥкра амоуп аконвекстә ӷба ала. PC1, ахәҭа хада 1; PC2, ахәҭа хада 2.
Анаҩс, ҳара абри абеиара аметод ҳхы иаҳархәеит CD4 +, CD8 +, CD45-целл фракциақәа рҿы 99 метаболит анализ азы, хҩык HGSC ауаа раԥхьатәи асцитқәеи ашәрақәеи рҿы (Асахьа 2С, Асахьа S3A, Аҭаӡҩыра S3, S4). Аинтерес зҵоу апопуляциа ԥсы зхоу ахәҭақәа раԥхьатәи аҿырԥштәы ду аҟынтәи 2% инаркны 70% рҟынӡа аҵанакуеит, насгьы ахәҭақәа рыхәҭаа ачымазаҩцәа рыбжьара даара еиԥшым. Ахәаӡқәа реиҟәыҭхара ашьҭахь, ибеиоу аинтерес зҵоу афракциа (CD4+, CD8+ ма CD45-) абжьаратәла аҿырԥштәы аҿы иҟоу ԥсы зхоу ахәҭақәа зегьы рҟынтәи 85% инареиҳаны ааннакылоит. Ари абеиара аметод алшара ҳнаҭоит ауаҩы ихәаҷа-маҷа ахәҭақәа рметаболизм аҟынтәи ахәҭақәа рпопуляциақәа ранализ аҟаҵара, уи аҿырԥштә дуқәа рҟынтәи аҟаҵара залшом. Абри апротокол ҳхы иархәаны, ҳара иаҳдырит l-кинуренини аденозини, абарҭ аҩ-иммуносупрессивтә метаболитқәа шьаҭанкыла ишыҳаракыз ашәра Т-хәыцрақәа ма ашәра ахәыцрақәа рҿы (Асахьа S3, В, С). Убри аҟнытә, абарҭ аҵыхәтәақәа иаадырԥшуеит ҳхәыцрақәа реиҟәыҭхаратәи амасс-спектрометриатәи атехнологиа ачымазаҩцәа рыхәҭақәа рҿы биологиала акыр зҵазкуа аметаболитқәа рыԥшаараҿы рыгәрагареи рылшареи.
Ҳара ҳаанализ иара убас иаанарԥшит ачымазцәа рыҩнуҵҟеи рыбжьара ахәҭа хкқәа рметаболизмтә еиҟәыҭхара ӷәӷәа (Асахьа 2D насгьы Асахьа S4A). Хықәкыла, егьырҭ ачымазцәа ирыҿырԥшны, ачымазаҩ 70 еиуеиԥшым аметаболизмтә ҟазшьақәа ааирԥшит (Асахьа 2Е, Асахьа S4B), уи иаанарԥшуеит ачымазцәа рыбжьара аметаболизмтә хетерогенра ду ыҟазар шалшо. Иазгәаҭатәуп, егьырҭ ачымазцәа (1,2 литр инаркны 2 литр рҟынӡа; Таблица S1) еиҿырԥшны, ачымазаҩ 70 (80 мл) еизгаз асцит зегьы еиҵан. Акомпонент хадақәа ранализ аамҭазы ачымазцәа рыбжьаратәи ахетерогенра ахылаԥшра (иаҳҳәап, ахәҭактәи аредунданциа анализ ахархәарала) ахәҭақәа рыбжьара еиқәшәоу аԥсахрақәа аанарԥшуеит, насгьы ахәҭақәа рыхкқәеи/мамзаргьы амикроеилазаареи еилыкка еизгоуп аметаболиттә профиль ала (Асахьа 2F ). Знызаҵәыктәи аметаболитқәа ранализ абарҭ аеффектқәа рҵакы аанарԥшит, насгьы ахәҭақәа рыхкқәеи амикроеилазаареи рыбжьара еиҳау аиԥшымрақәа аарԥшит. Иазгәаҭатәуп, зегь реиҳа иӷәӷәоу аиԥшымра иубаратәы иҟоу МНК шакәу, уи еиҳарак CD45- ацәеижьқәеи, CD4+, CD8+ ацәеижьқәеи рыла ибеиоуп, урҭ ашәыра иҭалоит (Асахьа 3А). CD4 + ахәыцрақәа рзы, ари аеффект еиҳа иеилкаауп, насгьы CD8 + ахәыцрақәа рҿы иҟоу МНКгьы акәша-мыкәшатә ҭагылазаашьа ӷәӷәала ианыруеит. Аха уи ҵакы амаӡам, избан акәзар, хҩык ачымазцәа рҟынтәи хҩык роуп CD8+ ҳәа изышьҭоу ачымазцәа рыхәшьара зылшо. МНА анахысгьы, асцитқәеи ашәрақәеи рҿы еиуеиԥшым ахәҭақәа рҿы, ТИЛ аҿы ибзианы иааԥшуа егьырҭ аметаболитқәагьы еиуеиԥшымкәа ибеиоуп (Асахьақәа S3, S4). Убри аҟнытә, абарҭ адыррақәа иаадырԥшуеит иммуномодулятортә метаболитқәа ргәыԥ анаҩстәи аҭҵаарақәа рзы.
(А) Асцит и ашәра рҟынтәи CD4+, CD8+, CD45- ацәеижьқәа рҿы МНК анормализациа зызу аҵакы. Асахьатә график иаанарԥшуеит агәыҭбаара (ацәаҳәа), аквартильбжьаратәи адиапазон (афреим ацәаҳәа) насгьы адыррақәа рдиапазон, аквартильбжьаратәи адиапазон 1.5 хынтә еиҳаны (афреим аԥаҵа). Ачымазаҩ иматериалқәеи аметодқәеи рҿы ишҳәоу еиԥш, ачымаза илимма аҵакы ахархәарала Р аҵакы еилкаатәуп (*Р<0.05 и **Р<0.01). (Б) МНК аметаболизм асхематә диаграмма (60). Аметаболитқәа: S-аденозил-1-метионин; САХ, S-аденозин-1-гомоцистеин; NA, никотинамид; МНА, 1-метилникотинамид; 2-ПИ, 1-метил- 2-пиридон-5-карбоксамид; 4-ПИ, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибоза; NMN, никотинамид мононуклеотид. Аензимқәа (иаҵәа): NNMT, никотинамид N-метилтрансфераза; SIRT, сиртуинқәа; NAMPT, никотинамид фосфорибозилтрансфераза; АОХ1, альдегид оксидаза 1; NRK, никотинамид рибозидкиназа; NMNAT, никотинамид моно Нуклеотид аденилат трансфераза; Pnp1, пурин нуклеозид фосфорилаза. (С) t-SNE scRNA-seq асцит (аҵәа) и ашәра (аҟаԥшь; n = 3 пациент). (D) NNMT еиуеиԥшым ахәҭақәа рпопуляциақәа рҿы scRNA-seq ахархәарала иалкаау аҳәара. (Е) NNMT еиԥш AOX1 рэкспрессиа SK-OV-3, ауаҩы имбрионтә бҩа (HEK) 293T, Т-хәыцқәеи МНА-ла ихәышәтәыз Т-хәыцқәеи рҿы. Ацәаҳәа SK-OV-3 ахь еизыҟоу аарԥшуп. SEM ацны аҳәашьа ахсаала аарԥшуп (n = 6 згәы бзиоу донорцәа). Ct 35 аасҭа еиҳау аҵакқәа ԥшаашьа змам (UD) ҳәа иԥхьаӡоуп. (F) SLC22A1 и SLC22A2 рэкспрессиа SK-OV-3, HEK293T, Т-целлқәеи Т-целлқәеи рҿы 8мМ МНА рыла ихәышәтәыз. Ацәаҳәа SK-OV-3 ахь еизыҟоу аарԥшуп. SEM ацны аҳәашьа ахсаала аарԥшуп (n = 6 згәы бзиоу донорцәа). Ct 35 аасҭа еиҳау аҵакқәа ԥшаашьа змам (UD) ҳәа иԥхьаӡоуп. (G) Ацелл МНК аҵакы активтәу агәабзиара змоу донортә Т-целлқәа рҿы 72 сааҭ МНК рыла аинкубациа ашьҭахь. SEM ацны аҳәашьа ахсаала аарԥшуп (n = 4 згәы бзиоу донорцәа).
МНК ҟаҵоуп аметилтә гәыԥ S-аденозил-1-метионин (SAM) ахьтә никотинамид (NA) ахь никотинамид N-метилтрансферазала (NNMT; Асахьа 3В) аиагарала. NNMT еиуеиԥшым ауаҩытәыҩсатә канцертә хәышәтәырҭақәа рҿы мыцхәы иаарԥшуп, насгьы апролиферациа, аинвазиа, аметастазқәа ирыдҳәалоуп (25-27). ТМЕ аҿы Т-хәыцрақәа рҿы МНА ахыҵхырҭа еиҳа еиӷьны аилкааразы, ҳара scRNA-seq ҳхы иаҳархәеит NNMT хҩык HGSC ачымазаҩцәа асцитқәеи рышәрақәеи рҿы ахәҭа хкқәа рыбжьара NNMT аҟазаара ахарактеристика аҭаразы (Таблица S5). 6,500 рҟынӡа ахәыцрақәа ранализ иаанарԥшит, асцитқәеи ашәра ахьыҟоу аҭыԥқәеи рҿы, NNMT аекспресиа ҳәа иԥхьаӡоу афибробластқәеи ашәра рыхәҭақәеи рпопуляциақәа рҟны мацара ишыҟаз (Асахьа 3, С, Д). Иазгәаҭатәуп, PTPRC (CD45 +) аазырԥшуа иарбанзаалак апопуляциаҿы еилкаау NNMT аҳәара шыҟам (Асахьа 3D, Асахьа S5A), уи иаанарԥшуеит аметаболиттә спектр аҿы иԥшаау МНА Т-хәыцрақәа ишрылаҵаз. Альдегид оксидаза 1 (AOX1) аҟазаара МНК 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид (2-PYR) ма 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид (4- PYR) ахь иаԥсахуеит; 3В асахьа) COL1A1 аазырԥшуа афибробластқәа рпопуляциа мацара ауп изызку (Асахьа S5A), урҭ зегьы еицырзеиԥшу МНК аметаболизм алшара шрымам аадырԥшуеит. Абарҭ МНК-и иадҳәалоу агенқәа рэкспрессиатә ԥшра шьақәырӷәӷәан аҩбатәи ихьыԥшым ахәҭақәа рдыррақәа рыла, HGSC ауаа рҟынтәи асцит аҟынтәи (Асахьа S5B; n = 6) (16). Уи адагьы, МНА-ла ихәышәтәыз агәабзиара змоу донортә Т-хәыцрақәа рыԥхьаӡаратә полимеразтә еиԥшьратә реакциа (qPCR) анализ иаанарԥшит, SK-OV-3 анаҩстәи ахәыцрақәа рконтроль еиҿырԥшны, NNMT ма AOX1 зынӡа ишыҟамыз (Асахьа 3Е). Ари ҳзықәымгәыӷӡоз аҭакқәа иаадырԥшуеит МНК афибробластқәа ма ашәра рҟынтәи ТМЕ аҿы иҟоу ааигәа иҟоу Т-хәыцрақәа рахь ишҭыҵуа.
Акандидатцәа рахь иаҵанакуазаргьы, 1-3 рҟынӡа аорганикатә катионтә еиҭагаҩцәа рҭаацәара (OCT1, OCT2, OCT3) еиқәыршәоуп аӡыҭратә ныҟәгаҩ 22 (SLC22) аҭаацәара (SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3), аха МНА аныҟәгаҩцәа рпотенциал уажәгьы еилкааӡам (28). Агәабзиара змоу донортә Т-хәыцрақәа рҟынтәи мРНК QPCR иаанарԥшит SLC22A1 аекспресиа аҩаӡара лаҟә, аха SLC22A2 аекспресиа аҩаӡара ԥшаашьа змам, уи шьақәнарӷәӷәеит уи ԥаса алитератураҿы ишҳәаз (Асахьа 3F) (29). Уи иеиԥшымкәа, SK-OV-3 анаҩстәи ашәра ацәаҳәа аҩ-транспортерк рыҩаӡара ҳаракны иаанарԥшуан (Асахьа 3F).
Т-хәыцқәа адәныҟатәи МНК рыҭара алшара рымоу-ирымаму агәаҭаразы, иԥсыҽу донортә Т-хәыцқәа 72 сааҭ рыҩныҵҟа МНК еиуеиԥшым аконцентрациақәа рыла еиздырҳауан. Екзогентә МНК аныҟам, МНК ахәҭатә ҵакы еилкаашьа амам (Асахьа 3Г). Аха, екзогентә МНК-ла ихәышәтәыз активтәу Т-хәыцрақәа иаадырԥшит ахәыцрақәа рҿы МНК-тә ҟазшьа адоза иахьыԥшу аизырҳара, 6 мМ МНК аҟынӡа (Асахьа 3Г). Абри аҵыхәтәа иаанарԥшуеит, атранспортертә експресиа аҩаӡара лаҟәзаргьы, ахәышәҭаҩныҵҟатәи МНК аметаболизм азы аҭакԥхықәра зду анзим хада ыҟамзаргьы, ТИЛ уеизгьы МНК агара шалшо.
Ачымазцәа рТ-хәыцрақәа рҿы иҟоу аметаболитқәа рспектр, насгьы in vitro МНК абсорбциа аԥышәарақәа аканцер иадҳәалоу афибробластқәа (CAF) МНК рылҵра алшара еиздырҳауеит, насгьы ашәратә хәыцрақәа ТИЛ афенотипи аусуреи еиҿыркаауеит. МНК Т-хәыцрақәа ирнаҭо анырра аилкааразы, агәабзиара змоу донортә Т-хәыцрақәа in vitro рыла МНК ыҟаны ма иҟамкәа иҟаҵаны, урҭ рылаҵәареи ацитокинқәа раартреи рыхәшьара ҟаҵан. мшы иреиҳау адоза ала МНА ацҵара ашьҭахь, апопуляциа ҩынтәны аизырҳара абжьаратәи ахыԥхьаӡара еиҵахеит, аха амчхара еиқәырханы иҟан адозақәа зегьы рҿы (Асахьа 4А). Уи адагьы, екзогентә МНК ахәышәтәра CD4 + CD8 + Т-хәыцрақәа рыхәҭаа еизҳаит, урҭ рҿы ашәра анекрозтә фактор-α (TNFα; Асахьа 4В) аазырԥшуеит. Уи иеиԥшымкәа, IFN-γ ахәыцрақәа рыҩнуҵҟа аҟаҵара CD4 + T ахәыцрақәа рҿы еиҳа имаҷхеит, аха CD8 + T ахәыцрақәа рҿы еиҳа имаҷхеит, насгьы интерлеукин 2 (IL-2; Асахьа 4, C, D) аҿы еиҳа аԥсахра ҟамлеит. Убри аҟнытә, анзимқәа ирыдҳәалоу иммуносорбенттә анализ (ELISA) абарҭ МНА-ла ихәышәтәыз Т-хәыцрақәа ркультурақәа рҟынтәи асупернатантқәа рҿы иаанарԥшит TNFα еиҳаны еизҳаит, IFN-γ еиҵахеит, IL-2 ԥсахра ҟамлеит (Асахьа 4, Е инаркны G рҟынӡа). . IFN-γ аиҵахара иаанарԥшуеит МНА Т-хәыцрақәа рҿагыларатә усура аанкылараҿы ароль шаанахәо. МНК Т-хәыцрақәа рыла еиҿкаау ацитотоксикизм ахь иамоу аҟазшьа аиҿырԥшразы, химертә антигентә рецептор Т (FRα-CAR-T) ахәыцрақәа, афолаттә рецептор α-и, CAR-T (GFP) зықәкны иҟоу, аиаҵәа флуоресценттә протеин (GFP) -CAR-T) ахәыцрақәа рыла еиҿкаауп, иԥсыҽу донортә перифериатә хәыцрақәа мононуреартә шьа ПБМЦ). CAR-T ахәыцқәа 24 сааҭ рыҩныҵҟа МНА ыҟаны еиздырҳауан, насгьы ауаҩытәыҩсатә SK-OV-3 анаҩстәи ашәратә хәыцқәа рыла еицҵаны еиздырҳауан, афолаттә рецептор α аазырԥшуа афолаттә рецептор α 10:1 еизыҟазаашьала. МНА ахәышәтәра FRα-CAR-T ахәыцқәа ршьратә усура ӷәӷәала еиҵахеит, уи аденозин ала ихәышәтәыз FRα-CAR-T ахәыцқәа иреиԥшын (Асахьа 4Н).
(А) Зегьы еизакны зыԥсы ҭоу ахәҭақәа рыԥхьаӡареи апопуляциа ҩынтәны аизырҳара (PD) ишиашоу акультура аҟынтәи амш 7. Абар-график иаанарԥшуеит агәабзиара змоу фҩык адонорцәа рыбжьаратәи + SEM. Иаанарԥшуеит n = 3 ихьыԥшым аԥышәарақәа рҟынтәи адыррақәа. (B to D) CD3/CD28 и IL-2 рхы иадырхәеит Т-хәыцқәа 7 мшы рыҩныҵҟа р-МНК-концентрациақәа рҿы раарԥшразы. Анализ ҟаҵахаанӡа, ахәыцқәа 4 сааҭ рыҩныҵҟа ПМА/иономицин ала GolgiStop ацхыраарала рстимуляциа рзуын. Т-хәыцрақәа рҿы TNFα (B) аҟазаара. Аҿырԥштәы асахьа (арӷьарахь) насгьы аҭаӡҩыратә дыррақәа (арӷьарахь) TNFα ԥсы зхоу ахәыцрақәа рҿы аҟазаара. Т-хәыцрақәа рҿы IFN-γ (C) и IL-2 (D) рцәырҵра. Ацитокинқәа рцәырҵра ршәеит ацәқәырԥаратә цитометриала. Абар график иаанарԥшуеит абжьаратәи (n = 6 згәабзиара бзиоу донорцәа) + SEM. Р аҵакы ашьақәыргыларазы аварианс ганклатәи анализ ахархәара, насгьы еиҭаҟаҵоу ашәагаақәа (*Р<0.05 и **Р<0.01). Иаанарԥшуеит n = 3 ихьыԥшым аԥышәарақәа рҟынтәи адыррақәа. (E to G) CD3/CD28 и IL-2 рхы иадырхәеит Т-хәыцқәа 7 мшы рыҩныҵҟа р-МНК-концентрациақәа рҿы раарԥшразы. Амедиум еизган ПМА/иономицин стимуляциа 4 сааҭ раԥхьаи ашьҭахьи. ТНФа (Е), ИФН-γ (Ф) и ИЛ-2 (Г) рконцентрациақәа ршәеит ЕЛИСА ала. Абар график иаанарԥшуеит абжьаратәи (n = 5 згәабзиара бзиоу донорцәа) + SEM. Р аҵакы еилкаауп варианс анализ ганкла, насгьы еиҭаҟаҵоу ашәарақәа рыла (*Р<0.05). Акәаԥ змоу ацәаҳәа иаанарԥшуеит аԥшаара аҳәаа. (H) Ахәыцрақәа рылизис анализ. FRα-CAR-T ма GFP-CAR-T ацәеижьқәа аденозин (250мкМ) ма МНК (10 мМ) рыла 24 сааҭ рыҩныҵҟа ирҽеиуан, мамзаргьы ихәышәтәымкәа иаанрыжьит (Ctrl). SK-OV-3 ахәыцқәа ршьра апроцент ашәара мҩаԥган. Р аҵакы еилкаауп Уэлч t тест ала (*Р<0.5 и **Р<0.01).
МНК-еиқәыршәоу ТНФα аекспресиа аиҿкаара амеханизмтә еилкаара аиуразы, МНК-ла ихәышәтәыз Т-хәыцрақәа рҿы ТНФα мРНК аҿы аиҭакрақәа рыхәшьара ҟаҵан (Асахьа 5А). МНА-ла ихәышәтәыз агәабзиара змоу донортә Т-хәыцрақәа ТНФα транскрипциа аҩаӡара ҩынтәны еизҳаит, уи иаанарԥшуеит МНА ТНФα транскрипциатә еиҿкаара ишадҳәалоу. Ари амҩақәҵаратә механизм аҭҵааразы, TNFα еиҿызкаауа ҩ-транскрипциатә факторк, еиҳарак активтәу Т-хәыцратә нуклеартә фактор (NFAT) еиԥш, иҷыдоу апротеин 1 (Sp1), ахәшьара рыҭан МНА апроксимальтә TNFα апромотор ахь аимадара аҭакс ( 30 ). TNFα апромотораҿы иҟоуп 6 иалкаау NFAT еидызкыло аҭыԥқәеи 2 Sp1 еидызкыло аҭыԥқәеи, ҭыԥк аҿы еиқәыԥсоу [-55 базтә ҩызцәа (бп) 5'cap аҟынтә] (30). Хроматинтә иммунопреципитациа (ЧИП) иаанарԥшит, МНК ала ахәышәтәра аныҟала, Sp1 TNFα апромотора амазаара хынтә еизҳаит. НФАТ алагаларагьы еизҳаит, аҵакы азааигәахеит (Асахьа 5Б). Абарҭ адыррақәа иаадырԥшуеит МНА Sp1 транскрипциала TNFα аҟазаара еиҿнакаауеит, насгьы еиҳа имаҷны NFAT аҟазаара.
(А) МНА ада еизҳаз Т-хәыцрақәа ирыҿырԥшны, МНА-ла ихәышәтәыз Т-хәыцрақәа рҿы ТНФα аекспресиа аҽеиҭакра. SEM ацны аҳәашьа ахсаала аарԥшуп (n = 5 згәы бзиоу донорцәа). Иаанарԥшуеит n = 3 ихьыԥшым аԥышәарақәа рҟынтәи адыррақәа. (Б) 8 мМ МНА рыла ма рыда ихәышәтәыз Т-хәыцрақәа рпромотор TNFα NFAT ашьҭахь, Sp1 еидҵан (Ctrl) насгьы PMA/иономицин стимуляциа 4 сааҭ рыҩныҵҟа. Иммуноглобулин G (IgG) и H3 иммунопреципитациазы негативтәи апозитивтәи аконтрольқәа реиԥш ахархәара роуит. ЧИП ақәҵара иаанарԥшит, МНА-ла ихәышәтәыз ахәыцрақәа рҿы Sp1, NFAT рыдҳәалара TNFα апромотораҿы акырынтә ишеизҳаз, аконтрольтә ҭагылазаашьа иаҿырԥшны. Иаанарԥшуеит n = 3 ихьыԥшым аԥышәарақәа рҟынтәи адыррақәа. Р аҵакы еилкаауп еиуеиԥшым t-тестқәа рыла (*** Р <0.01). (С) HGSC асцит еиҿырԥшны, Т-хәыцқәа (цитотоксиктәым) иаадырԥшит еиҳаны ТНФ аҟазаара ашәраҿы. Аԥштәқәа еиуеиԥшым ачымазцәа аадырԥшуеит. Иаарԥшу ахәҭақәа 300 рҟынӡа еиԥҟьаны асамбль рыҭан, насгьы џьиттер ҟаҵоуп, еиҳаны асахьа ҭыхра ԥкра аиурц азы (** Padj = 0.0076). (D) Аовариантә канцер азы МНА амодель ҟаҵоуп. МНА ҟаҵоуп ТМЕ аҟны иҟоу ашәратә хәыцқәеи афибробластқәеи рҿы, насгьы Т-хәыцқәа ирыдыркылоит. МНА Sp1 TNFα апромотораҿы аимадара еизнарҳауеит, уи TNFα транскрипциеи TNFα ацитокин аҟаҵареи еизнарҳауеит. МНА иара убасгьы ИФН-γ аиҵахара аанарԥшуеит. Т-хәыцқәа рфункциа аанкылара ашьратә лшара аиҵатәреи ашәра арццакреи ирыхҟьоит.
Аҳасабырбақәа рыла, TNFα ԥхьаҟеи шьҭахьҟеи еиқәыршәоу анти-тумортәи анти-тумортәи еффектқәа амоуп, аха уи еицырдыруа ароль амоуп анаҩстәи аканцер аизҳареи аметастазқәеи рыцхраараҿы (31-33). Аҳасабырбақәа рыла, анаҩстәи аканцер змоу ачымазцәа рҿы асцитқәеи ашәратә тканьқәеи рҿы TNFα аконцентрациа еиҳауп, ацәеижь бзиақәа рҿы иҟоу аконцентрациа аасҭа (34-36). Амеханизм аганахьала, TNFα ашьа шкәакәақәа рылаҵара, рфункциа, рылаҵәара еиҿнакаауеит, насгьы аканцертә хәыцрақәа рфенотип аԥсахра алшоит (37, 38). Абарҭ аԥшаарақәа инарықәыршәаны, адифференциалтә гентә експресиа анализ иаанарԥшит, ТНФ еиҳа ишыӷәӷәаз Т-хәыцрақәа рҿы, асцит иаҿырԥшны (Асахьа 5С). ТНФ аекспресиа аизҳара убаратәы иҟан цитотоксиктәым фенотип змоу Т-хәыцрақәа рпопуляциақәа рҿы мацара (Асахьа S5A). Ажәакала, абарҭ адыррақәа ишьақәдырӷәӷәоит МНА ҩ-иммуносупрессивтәи ашәра аизырҳаратәи еффектқәа HGSC аҿы иамоуп ҳәа агәаанагара.
Ацитометриа шьаҭас измоу афлуоресценттә маркировка ТИЛ аметаболизм аҵараҿы ихадоу методны иҟалеит. Абарҭ аҵарақәа иаадырԥшит, аперифериатә шьа алимфоцитқәа ма аҩбатәи алимфоидтә цәеижьхәҭақәа рҟынтәи Т-хәыцрақәа ирыҿырԥшны, аҳәынаԥи ауаҩытәыҩсеи ТИЛқәа агликоза рыдкылара еиҳа ишыӷәӷәоу (4, 39), насгьы ԥыҭ-ԥыҭла амитохондриалтә функциа ацәыӡра (19, 40). Ари ҭҵаара аҿы еиԥшу алҵшәақәа ҳбахьеит, аха ихадоу аҿиара ҳәа иԥхьаӡоуп еиԥшу ацәеижьтә хәҭақәа рҟынтәи аҳәынҵәа ахәыцқәеи ТИЛ-и рметаболизм аиҿырԥшра. Абарҭ ԥасатәи аҳасабырбақәа рҟынтәи џьоукы инарықәыршәаны, асцитқәеи ашәрақәеи рҟынтәи ашәра (CD45-EpCAM +) ахәыцқәа CD8 + CD4 + Т-хәыцрақәа раасҭа агликоза еиҳаны ирыдыркылоит, уи иаанарԥшуеит ашәра ахәыцқәа рҿы агликоза еиҳаны рыдкылара Т-хәыцрақәа ирыҿурԥшыр шалшо. Т-хәыцрақәа реицлабра аконцепциа. ТМЕ. Аха ашәратә хәыцрақәа рмитохондриалтә усура CD8 + T хәыцрақәа раасҭа еиҳауп, аха амитохондриалтә усура CD4 + T хәыцрақәа рмитохондриалтә усура еиԥшуп. Абарҭ аҭҵаарақәа иарӷәӷәоит ицәырҵыз атема, оксидативтә метаболизм ашәыратә хәыцрақәа рзы акырӡа аҵанакуеит ҳәа (41, 42). Урҭ иара убас иазгәарҭоит CD8 + Т-хәыцрақәа CD4 + Т-хәыцрақәа раасҭа оксидативтә дисфункциа еиҳа ишырзымариоу, мамзаргьы CD4 + Т-хәыцрақәа амитохондриалтә усура рыхьчаразы агликоза ада даҽа карбонтә хыҵхырҭақәак рхы иадырхәар шрылшо (43, 44). Иазгәаҭатәуп, асцит аҿы CD4 + T еффекторқәа, Т еффектортә гәынкылара, Т централтә гәынкылара рыхәыцрақәа рыбжьара агликоза агара ма амитохондриалтә усураҿы еиԥшымзаарак шҳамбоз. Убасҵәҟьа, CD8 + Т-хәыцрақәа рыдифференциациатә ҭагылазаашьа ашәраҿы агликоза агара аԥсахрақәа ирыдҳәалам, уи in vitro еизҳауа Т-хәыцқәеи ауаҩытәыҩсатә TIL in vivo рыбжьара иҟоу аиԥшымра ду аанарԥшуеит (22). Абарҭ ахылаԥшрақәа шьақәдырӷәӷәеит еилых ҟамҵакәа автоматтә хәыцрақәа рпопуляциа аихшара ахархәарала, уи иаанарԥшит CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + хәыцрақәа еиҳа агликоза здызкыло, амитохондриалтә активра змоу, ашәратә хәыцрақәа раасҭа еиҳаны ишыҟоу, аха аметаболизмтә активтә хәыцрақәа рыпопуляциа шрымоу. Ари апопуляциа scRNA-seq анализ аҿы иалкаау амиелоидтә супрессортә хәыцрақәа мамзаргьы плазмацитоидтә дендриттә хәыцрақәа рпопуляциа ҳәа иԥхьаӡоу асубпопуляциа аанарԥшыр алшоит. Аҩбагьы ауаҩы икәацтә шьаҭақәа рҿы ишыҟоугьы [45], урҭ уажәгьы иаҭахуп Иҵегьтәи аусура ари амиелоидтә субпопуляциа аарԥшра.
Ацитометриа ацәырҵра шьаҭас измоу аметодқәа ахәыцрақәа рыбжьара агликозеи аоксидативтә метаболизми азеиԥш еиԥшымрақәа рыҭҵаара рылшоит, аха агликоза ма егьырҭ акарбонтә хыҵхырҭақәа ТМЕ аҿы амитохондриалтә метаболизм азы иҟарҵо ииашоу аметаболитқәа макьана иҭҵааӡам. Аметаболитқәа рыҟазаара ма рыҟамзаара иарбоу ТИЛ ахәҭаҷ ахь анагара азы иаҭахуп ахәҭақәа рпопуляциа арыцқьара. Убри аҟнытә, ҳхәыцрақәа рбеиара аметод масс-спектрометриа иацҵаны, Т-хәыцрақәеи ашәратә хәыцрақәа рпопуляциақәеи рҿы еиуеиԥшымкәа ибеиоу аметаболитқәа рзы адыррақәа ҳнаҭоит, ачымазаҩцәа рҿырԥштәқәа реиқәшәараҿы. Ари аметод флуоресценциала иҟоу ахәҭақәа реилыԥшаара аасҭа еиӷьуп, аха еиуеиԥшым аметаболиттә библиотекақәа рҿы анырра роур ауеит, еиуеиԥшым аҭышәынтәалареи/мамзаргьы ирласны аиҭныԥсахлара амҽхаки рзы (22). Ус шакәугьы, ҳметод иалнаршеит ҩ-иммуносупрессивтә метаболитқәак, аденозин, кинуренин, ралкаара, избан акәзар урҭ аҿырԥштәқәа рыхкқәа рыбжьара даара еиԥшым.
Ҳара ҳметабономтә анализ ашәрақәеи ТИЛ ахәҭақәеи рзы еиҳаны адыррақәа ҳнаҭоит анаҩстәи ТМЕ аҿы аметаболитқәа рроль азы. Актәи, ацәырҵратә цитометриа ҳхы иархәаны, ҳара иаҳдырит ашәрақәеи CD4 + Т-хәыцрақәеи рыбжьара амитохондриалтә усураҿы еиԥшымзаарак шыҟам. Аха LC-MS/MS анализ иаанарԥшит абарҭ апопуляциақәа рыбжьара аметаболитқәа рырацәараҿы аиҭакра дуқәа, уи иаанарԥшуеит ТИЛ аметаболизми иааизакны аметаболизмтә усуреи ирызку алкаақәа гәцаракрала рыҭҵаара шаҭаху. Аҩбатәи, МНА CD45-целлқәеи Т-целлқәеи рыбжьара еиҳа аиԥшымзаара змоу аметаболит ауп, асцит аҿы, ашәра акәымкәа. Убри аҟнытә, акомпартментализациеи ашәра ахьыҟоу аҭыԥи ТИЛ аметаболизм аҿы еиуеиԥшым аныррақәа рымазар ауеит, уи иалкаау микроеилазаараҿы иҟалар зылшо ахетерогенра аанарԥшуеит. Хԥатәи, МНК-ҭзыжьуа аензим NNMT аҟазаара еиҳарак CAF аҟны мацара ауп иахьыҟоу, уи еиҳа имаҷны ашәратә хәыцрақәа роуп, аха еилкаахо МНК аҩаӡарақәа ашәра иалҵыз Т-хәыцрақәа рҿы иубаратәы иҟоуп. NNMT еиҳаны аҽаҭара анаҩстәи CAF аҿы еицырдыруа аканцер аизырҳаратә еффект амоуп, хәҭак ала CAF аметаболизм аизырҳара, ашәра ақәылара, аметастазқәа рыла (27). ТИЛ иааизакны аҩаӡара бжьаратәизаргьы, NNMT аҟазаара CAF аҿы ӷәӷәала иадҳәалоуп Cancer Genome Atlas (TCGA) амезенхимтә субтип, уи еиҵоу апрогноз иадҳәалоуп (27, 46, 47). Аҵыхәтәан, МНК аилабгаразы аҭакԥхықәра зду анзим AOX1 аҟазаарагьы CAF апопуляциаҿы мацара ауп иахьыҟоу, уи иаанарԥшуеит Т-хәыцрақәа МНК аметаболизм аҟаҵара рылшара шрымам. Абарҭ аҭҵаарақәа ишьақәдырӷәӷәоит агәаанагара, абри аԥшаара ашьақәырӷәӷәаразы иҵегьы аусура аҭахызаргьы, Т-хәыцрақәа рҿы МНК аҩаӡара ҳаракқәа аиммуносупрессивтә CAF микроеилазаара шыҟоу аанарԥшыр алшоит.
МНК аныҟәгаҩцәа рэкспрессиа аҩаӡара лаҟәи, МНК аметаболизм иалахәу ихадоу апротеинқәа рыҩаӡарақәеи ҳрызхәыцуазар, Т-хәыцрақәа рҿы МНК аҟазаара ҳзықәымгәыӷӡоз акоуп. NNMT еиԥш AOX1 еиԥш scRNA-seq анализи ҩ-кохортк рҟынтәи qPCR хықәкыла рыԥшаара залымшеит. Абарҭ аҭакқәа иаадырԥшуеит МНА Т-хәыцрақәа рыла ишышьақәгылам, аха иаакәыршаны иҟоу ТМЕ аҟынтәи ишҭанагало. Ин витро аԥышәарақәа иаадырԥшуеит Т-хәыцқәа екзогентә МНК еизырҳауеит ҳәа.
Ҳара ҳ-ин витро ҭҵаарақәа иаадырԥшит еизогентә МНК Т-хәыцрақәа рҿы ТНФα аҟазаара шцәырнаго, насгьы Sp1 ТНФα апромотор ахь аимадара шеиӷьнатәуа. ТНФα анти-тумортәи анти-тумортәи афункциақәа амоуп, аха анаҩстәи аканцер аҿы, ТНФα анаҩстәи аканцер аизҳара ацхраар алшоит (31-33). ТНФα анеутрализациа аовариантә шьаҭа ахәыцрақәа ркультураҿы ма агәынаҳәа амодельқәа рҿы ТНФα асигнал аԥыхра TNFα-медиированный инфламаторный цитокин производство еиӷьнатәыр алшоит, насгьы шьаҭа аизҳара аанкылара алшоит (32, 35). Убри аҟнытә, абри аҭагылазаашьаҿы, ТМЕ-иалҵыз МНА аутокринтә цикл ала ТНФα-еиқәыршәоу амеханизм ала проинфламатортә метаболит еиԥш аус ауеит, уи ала анаҩстәи аканцер ацәырҵреи аларҵәареи ацхраауеит (31). Абри алшара инақәыршәаны, TNFα аблокада анаҩстәи аканцер азы ахәшәтәратә агент еиԥш иҭҵаахоит (37, 48, 49). Уи адагьы, МНА CAR-T ахәыцқәа рцитотоксикизм еиланарбгоит анаҩстәи ашәра ахәыцқәа рахь, уи МНА-медиациатә иммунтә супрессиа азы иҵегьы ашьақәырӷәӷәарақәа аанагоит. Иааидкыланы, абарҭ аҵыхәтәақәа иаадырԥшуеит амодел, ашәрақәеи CAF ахәыцқәеи МНА ацеллулартә ТМЕ ахь иахьҭырҵәаауа. (i) ТНФ-индуцированная стимуляция роста рака оварии и (ii) МНА-индуцированная Т-клеточная цитотоксичная активность ингибиции, это может иметь двойной эффект опухоли (Фигура 5D).
Аҵыхәтәаны, ирццакуа ахәҭақәа рбеиара, ахәҭактәи аишьҭагыла, аметаболизмтә профиль аҟаҵара еилаҵаны ахархәарала, ари ҭҵаара иаанарԥшит HGSC ихәышәтәуа ачымазцәа рҿы ашәрақәеи асцит ахәҭақәеи рыбжьара иммунометаболомтә еиԥшымзаара дуқәа. Абри зегь зымҽхакуа анализ иаанарԥшит Т-хәыцрақәа рыбжьара агликоза агареи амитохондриалтә усуреи рҿы аиԥшымрақәа шыҟоу, насгьы МНК-хәыцрақәа ракәым автономтә иммунтә еиҿкааратә метаболитны иалкаан. Абарҭ адыррақәа анырра рырҭоит ТМЕ ауаҩы иканцертә хкы аҿы Т-хәыцрақәа рметаболизм ишаныруа. Т-хәыцрақәеи аканцертә хәыцрақәеи рыбжьара анытриентқәа рзы ииашаны аицлабра шыҟоугьы, аметаболитқәа ииашамкәа арегуляторқәа реиԥш аус руеит, ашәра аизырҳара ацхрааразы, насгьы, иҟалап, андогентә иммунтә ҭакқәа рыхәаҽразы. Абарҭ аиҿкааратә метаболитқәа рфонкционалтә роль анаҩстәи ахҳәаа ашәраҿагыларатә иммунтә ҭакԥхықәра арӷәӷәаразы альтернативтә стратегиақәа аанартуеит.
Ачымазаҩцәа рҿырԥштәқәеи аклиникатә дыррақәеи роуит Канадатәи ахәҭақәа рыҵәахырҭа аҳәаа ала асертификат змоу BC аканцертә шьаҭа ахәҭақәа рыҵәахырҭа ала. BC Cancer Research Ethics Committee and British Columbia University (H07-00463) ирыдыркылаз апротокол инақәыршәаны, ачымазцәа зегьы рҿырԥштәқәеи рыклиникатә дыррақәеи рзы еилкааны ҩыралатәи ақәшаҳаҭра роуит, мамзаргьы формала рқәшаҳаҭра аанрыжьит. Аҿырԥштәқәа ҵәахуп асертификат змоу Биобанк аҿы (BRC-00290). Ачымазаҩ иҟазшьақәа ртәы еиҳа инарҭбааны иаагоуп аҭаӡҩырақәа S1, S5 рҿы. Акриопресервациазы, аскалпель рхы иадырхәоит ачымаза ихәаҷа-маҷа аҿырԥштәы механикала еилабганы, нас 100-микронтәи афильтр иҭаҵаны, хылԥактәи асуспензиа аиуразы. Ачымазаҩ иасцит 1500 rpm 10 минуҭк 4°C аҟны центрифуга рзыҟаҵан, ахәыцқәа пеллетла еиқәыршәаны, насгьы ацәеижь ацәа ақәгаразы. Ашәрақәеи асцитқәеи рҟынтәи иаагоу ахәыцқәа 50% аԥхарала инактивациа зызу ауаҩытәыҩсатә АВ ацәеижь (Сигма-Алдрич), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) 10% диметилсульфоксид рҿы криоконсервациа рзыҟаҵан. Абарҭ еиқәырхаз хылԥа заҵәыктәи асуспензиақәа ӡааҵаны, ҵаҟа иарбоу аметаболомикеи аметаболитқәа рыԥшаареи рзы ахархәара роуит.
Агәыҭбаара зегьы 0.22 мкм 50:50 еилырхуа RPMI 1640: AimV ала ишьақәгылоуп. RPMI 1640 + 2.05 мМ л-глутамин (Термо Фишер Саиентифик) дополнен 10% теплоинактивированного человеческого AB серума (Сигма-Олдрич), 12.5 мМ Хепес (Термо Фишер Саиентифик), 2 мМ л-глутамин (Терфик Фишер Саиентифик) Стрептомицин (ПенСтреп) ахҭәаша (Термо Фишер Саиентифик) 50 мкМБ-меркаптоетанол. AimV (Invitrogen) 20 мМ Hepes (Термо Фишер Саиентифик) 2 мМ л-глутамин (Термо Фишер Саиентифик) рыла иацҵоуп. Ацитометр ацәырҵратә буфер 0.22мкм еилырхыз афосфаттә буфертә ҵаа (PBS; Invitrogen) 3% аԥхарала инактивтәу AB ауаҩытәыҩсатә шьаҭа (Sigma) ацҵаны иҟан. Ахәыцрақәа рбеиаратә буфер 0.22мкм еилырхуа PBS ала ишьақәгылоуп, насгьы 0.5% аԥхарала инактивациа зызу ауаҩытәыҩсатә AB ацәа (Сигма-Олдрич) ала иҭәуп.
37°C ахь инеиуа аҭагылазаашьаҿы, ахәыцқәа 10 нМ МТ ДР рыла 100 мкМ 2-НБДГ рыла 30 минуҭк рыҩныҵҟа иҟәашьын. Анаҩс, ахәыцқәа 4°C аҟны 15 минуҭ рыҩныҵҟа аԥсҭазааратә шьаҭа eF506 ала иршәит. Ахәыцқәа FC Block (eBioscience) еиԥш Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) рҿы еиҭаҵатәуп, ацитометр ашәыгатә буфер аҿы ирӡаатәуп (аҭыжьыҩ иҟаиҵаз абжьгарақәа рыла), насгьы 10 минуҭк ауада аҳауа атемператураҿы иҭарҵоит. Ахәыцқәа антицелақәа рыла (Таблица S2) 4°C атемператураҿы 20 минуҭ рыҩныҵҟа ацитометриа ашәыгатә буфер аҿы рышәра. Анализ ҟаҵахаанӡа ахәыцқәа ацитометриа ашәыгатә буфер аҿы (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигурациа) еиҭаҵатәуп. Ихархәа SpectroFlo и FlowJo V10 анализ азы ахәҭақәа рыԥхьаӡара адыррақәа, насгьы ахархәара GraphPad Prism 8 адыррақәа раԥҵаразы. 2-NBDG еиԥш MT DR рмедиантә флуоресценциатә интенсивра (MFI) лог-нормализациа азуын, насгьы еиқәшәаз ачымазцәа рыԥхьаӡаразы астатистикатә анализ азы ҩыџьаратәи t-тест ахархәан. 40-тәи ахҭысқәа раҵкыс еиҵаны змоу апопуляциақәа зегьы анализ аҟынтәи иаԥыхтәуп; ҭажәгал МФИ ахә 1 еиуеиԥшым негативтә ҵакқәа рзы астатистикатә анализи адыррақәа рвизуализациеи рынагӡара аԥхьа.
Хыхь иаагоу апроцесстә панель анапылатәи ашәқәа рыҭаратә стратегиа ахарҭәааразы, ҳара ҳхы иаҳархәеит аннотациа зегьы ашәагаа аԥкратә ҵла (FAUST) (21) ала, FlowJo аҿы иԥсхьоу ахәҭақәа анықәгаха ашьҭахь, автоматла ахәҭақәа апопуляциахь рыҭаразы. Ҳара напыла аҭҵаара мҩаԥаҳгоит ииашамкәа иалху еиԥш иҟоу апопуляциақәа реидҵаразы (PD1+ PD1-тумортә хәыцрақәа рыла еидҵаны) насгьы иаанхаз апопуляциақәа. Аҿырԥштәы зегьы иаҵанакуеит 2% инареиҳаны ахәыцқәа, иааизакны 11 популациа рзы.
Фиколл градиенттә ҵаӷара ацентрифуга ахархәара аиоуит ПБМЦ леукоцитқәа реиҟәыҭхаратә алыҵқәа рҟынтәи аиҟәыҭхаразы (STEMCELL Technologies). CD8 + Т-хәыцқәа PBMC-ҟынтәи иалкаан CD8 MicroBeads (Miltenyi) ахархәарала, насгьы TransAct (Miltenyi) ахархәарала 2 мчыбжь рыҩныҵҟа амедиум зегьы аҿы ирҭбааит, аҭыжьыҩ иҟаиҵаз абжьгарақәа рыла. Ахәыцқәа 5 мшы рыҩныҵҟа IL-7 (10 нг/мл; PeproTech) злоу аҭагылазаашьа зегьы аҿы иаанкыланы, анаҩс TransAct ала еиҭа рстимуляциа ҟаҵан. А7-тәи амш аҽны, аҭыжьыҩ иҟаиҵаз абжьгарақәа рыла, ауаҩытәыҩсатә CD45 MicroBeads (Miltenyi) х-раундк еишьҭаргыланы ахәыцқәа рбеиаразы ахархәара роуит. Ахәыцрақәа аликвота ҟаҵан ацәқәырԥаратә цитометриа анализ азы (хыхь ишҳәаз еиԥш), насгьы миллионк ахәыцқәа хынтә аликвота ҟаҵан LC-MS/MS анализ азы. Аҿырԥштәқәа LC-MS/MS ала аус рыдулара мҩаԥысит ҵаҟа ишаҳәоу еиԥш. Ҳара иаҳҳәеит иаҳцәыӡыз аметаболит аҵакы 1000 ионтә хыԥхьаӡарала. Аҿырԥштәы зегьы еизакны ионтә хыԥхьаӡарала (ТИК) инормалтәуп, логарифмла еиҭаргоит, анализ ҟаҵахаанӡа MetaboAnalystR аҿы автоматла инормалтәуп.
Ачымазаҩцәа зегьы рыхәҭа заҵәыктәи асуспензиа ӡааҵаны 40 мкм ҟазшьа змоу афильтр ала иҭәыз амедиум ахь ирыцқьан (хыхь ишҳәаз еиԥш). Аҭыжьыҩ ипротокол инақәыршәаны, CD8+, CD4+, CD45- ацәеижьқәа рзы асамбльқәа рбеиаразы MicroBeads (Miltenyi) ахархәарала амагниттә хәаӡқәа реиҟәыҭхарала х-раундк еишьҭагыланы еиҿкаан апозитивтә алхра. Иааркьаҿны иуҳәозар, ахәыцқәа ахәыцқәа рбеиаратә буфер аҿы (хыхь ишҳәаз еиԥш) еиҭаҵахоит, насгьы иԥхьаӡоуп. Ахәыцқәа ауаҩытәыҩсатә CD8 хәыцқәа, ауаҩытәыҩсатә CD4 хәыцқәа ма ауаҩытәыҩсатә CD45 хәыцқәа (Miltenyi) рыла 4°C 15 минуҭк рыла инкубациа рзуын, нас ахәыцқәа рбеиаратә буфер ала ирыӡәӡәон. Аҿырԥштәы LS аколона (Мильтени) иаҩсуеит, насгьы еизгахоит апозитивтәи анегативтәи афракциақәа. Аамҭа аркьаҿразы, насгьы ахәҭақәа реиҭашьақәгылара ашьаҿа аизырҳаразы, CD8-фракциа CD4+ абеиара аҩбатәи араунд азы ахархәара аиуеит, CD4-фракциа анаҩстәи CD45-абеиара азы ахархәара аиуеит. Аиҟәыҭхара апроцесс зегьы аҩнуҵҟа ахҭәаҵа аҵааҿы иаанкыланы иҟаҵатәуп.
Аметаболитқәа ранализ азы аҿырԥштәқәа рырхиаразы, ахәыцқәа знык ҵааҵас ихьшәашәоу ацәа рыла ирыӡәӡәон, насгьы 1 мл 80% аметанол аҿырԥштәқәа зегьы ирыцҵан, нас еикәарҳәны азот ӡыҭраҿы ирҵаауан. Аҿырԥштәқәа х-циклк рҵаа-ӡыҭратә циклқәа ирхысит, насгьы 14,000 rpm 15 минуҭк 4°C аҟны ацентрифуга рҭарҵеит. Аметаболитқәа злоу асупернатант ҩанӡа иҭабаахоит. Аметаболитқәа 50 мкл 0,03% форминтә ашьақар аҿы даҽазнык иӡааҵан, еилаԥсаны, нас центрифугала аԥхҭрақәа раныхразы.
Хыхь ишҳәаз еиԥш аметаболитқәа рыхгара. Аметаболомика аҭҵааразы асупернатант иҳараку аусуратә хроматографиатә ԥыҭрак ахь ииагатәуп. Агәыԥтә еффектқәа раԥырҟәҟәааразы еиԥшу ахыԥхьаӡара змоу ахәҭақәа рыла еиуеиԥшым аҿырԥштәқәа рыхәшәтәра азы еиԥҟьаны иҟоу ахәышәтәратә протокол ахархәара. Ҳара AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) аҿы уаанӡа иҭыҵыз аглобалтә метаболитқәа рхаҭашьатә хышәаара мҩаԥаҳгеит. Ахроматографиатә анализи апиктә ҭыԥқәа реинтеграциеи мҩаԥган MultiQuant версиа 2.1 апрограмматә еиқәыршәара (Applied Biosystems SCIEX) ахархәарала.
1000 ионтә ԥхьаӡара ахархәан ибжьаӡыз аметаболит аҵакы аԥхьаӡаразы, насгьы еиуеиԥшым аҿырԥштәқәа рТИК ахархәан иԥшааз аметаболитқәа зегьы рнормализациатә пиктә ҭыԥ аԥхьаӡаразы, аҿырԥштәқәа рыусура аҟынтәи аинструменталтә анализ ала иҟалаз аԥсахрақәа рыриашаразы. ТИК анормализациа ашьҭахь, MetaboAnalystR(51) (параметр стандарт) логарифмтә еиҭакреи автоматтә норматә цәаҳәа амасштаб ашьақәыргылареи рзы ахархәара аиуеит. Ҳара ҳхы иаҳархәеит PCA вегантә R пакет ацны, аҿырԥштәы хкқәа рыбжьара аметаболомтә еиԥшымрақәа рыԥшааратә анализ амҩаԥгаразы, насгьы ачымазцәа ранализ азы ахәҭактәи редунданциа анализ ҳхы иаҳархәеит. Уорд иметод ахархәара аԥхаратә карта дендрограмма аргыларазы, асамбльқәа рыбжьара Евклидовтәи абжьаӡара еизгаразы. Ҳара лимма (52) ҳхы иаҳархәеит стандартизациа зызу аметаболитқәа рырацәараҿы, еиуеиԥшым ахәҭақәа рырацәара зегьы рҿы еиуеиԥшым аметаболитқәа раарԥшразы. Аилыркаара армариаразы, ҳара ҳхы иаҳархәоит агәыԥ абжьаратәи апараметр, амодел аарԥшразы, насгьы амикроеилазаараҿы иҟоу ахәҭақәа рыхкқәа гәыԥцыԥхьаӡа (n = 6 гәыԥқәа); ҵакылатәи аԥышәа азы, ҳара х-шәагак ҟаҳҵеит метаболитцыԥхьаӡа Амцтә репликациа ҟамларц азы, ачымаза лимма адизаин аҿы ԥынгылас дҟаҵан. Еиуеиԥшым ачымазцәа рыбжьара аметаболитқәа реиԥшымрақәа рыгәаҭаразы, ҳара лимматә модель еиқәҳаршәеит ачымазцәа алархәны. Ҳара ҳҳәоит заа иалкаау аконтраст ахәҭа ахкыи Padj <0.05 амикроеилазаареи рыбжьара иҟоу аҵакы (Бенџамини-Хохберг ириашара).
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viability) ахархәарала амчхара абеиара ашьҭахь, 10x 5′гентә експресиа апротокол ахархәарала, зегьы еизакны еиқәырханы иҟоу асцитқәеи ашәрақәеи рҿы хәыцктәи транскриптомтә еишьҭагылара мҩаԥган. Анализ рзуын еиқәшәо ​​ашәрақәеи асцитқәеи змоу хә-ҭагылазаашьак рҿы, аха ашәра ҿырԥштәык аҟынтәи аԥсҭазаара ахьмаҷыз уи алаҵара иаԥырхагахеит. Ачымазцәа рацәаны ралхразы, 10х хромтә контроллер амҩақәа рҿы ачымазцәа зегьы рҿырԥштәқәа еидаҳкылеит, насгьы асцитқәеи ашәра ахьыҟоу аҭыԥқәеи хазы-хазы анализ рзаҳуит. Асеквенциа ашьҭахь [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp ҩыџьаратәи аҵыхәа (ПЕ), Квебектәи агеном; абжьаратәла 73,488 и 41,378 ԥхьара целл азы ашәра азы]], ҳара ҳхы иаҳархәеит CellSNP и Vireo (53) (CellSNP ашьаҭала еиԥш Ауаҩытәыҩсатә SNP (VCF) GRCh38 иаҭо генотиԥ донортә идентификациа аҭоуп. (IBS), еидҳәалам ахәыцқәеи ахәыцқәеи рыда, урҭ дуплексқәаны иалкаауп, насгьы асцитқәеи ашәыра асамбльқәеи рыбжьара еиқәшәо ​​адонорцәа (54) Ари адҵа аҵаҵӷәы ала, ҳара иаанхеит х-ҭагылазаашьак, ашәыраҿы ахәыцқәа рацәаны раарԥшра змоу, анализ ҟаҵаны ашьҭахь (BiCoran filtring step in the) 6975 ацәеижьқәа (2792 и 4183 ацәеижьқәа ашәыра аҟынтәи асцит, соответственно) анализ азы Ҳара ҳхы иаҳархәоит igraph's (57) Лувентәи акластеризациа еицырзеиԥшу агәылацәа рҳәаа (SNN) шьаҭас измоу Jaccard дистанциа акластертә ацәеижьқәа рҟынӡа marput annota on. насгьы t-SNE ала визуализациа зызу ацитотоксиктә Т-хәыцрақәа CD8A еиԥш GZMA рэкспрессиа ала иалкаауп, арибосомалтә протеин лаҟә змоу асубкластерқәа аламҵакәа Ҳара ҳнеит Izar et al (16) рҭыжьымҭа данноқәа, урҭ р-t-SNE ашьҭаҵара нарылаҵаны, иммунитеттә хәыцрақәа рыбжьара аиқәыԥсара анапхгара азура алшоит.
ПБМЦ еиҟәыҭханы иҟан леукоцитқәа реиҟәыҭхаратә алыҵқәа (STEMCELL Technologies) рҟынтәи Ficoll градиенттә ҵаӷаратә центрифугациала. CD3 + ацәеижьқәа PBMC аҟынтәи иалкаан CD3 ацәаҳәақәа (Miltenyi) рыла. МНК ыҟаны ма иҟамкәа, CD3+ ахәыцқәа рыла еиқәыршәан CD3 (5мкг/мл), иҭәу CD28 (3мкг/мл) насгьы IL-2 (300 U/ml; Proleukin) рыла. Аҽырҭбаара аҵыхәтәантәи амш аҽны, аԥсҭазааратә ҟазшьа (Фиксабельная ԥсҭазааратә шьаҭа еФлуор450, еБиосаинс) еиԥш, апролиферациа (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) еисратә цитометриала ахәшьара рыҭан. Аеффектортә функциа ахәшьара аҭара, ахәҭақәа рстимуляциа ала ПМА (20 нг/мл) и иономицин (1мкг/мл) рыла ГольгиСтоп 4 сааҭ рыҩныҵҟа, насгьы CD8-PerCP (RPA-T8, БиоЛегенда), CD4-AF700 (РПА-Т4) (РПА-Т4) , БиоФИЛегенд (МАб11, БД). qPCR и ChIP ацәеижьқәа ПМА (20 нг/мл) и иономицин (1мкг/мл) рыла 4 сааҭ рыҩныҵҟа рстимуляциа ҟаҵатәуп. ЕЛИСА-супернатант еизган ПМА (20 нг/мл) иономицин (1 мкг/мл) рыла 4 сааҭ рыҩныҵҟа астимуляциа аԥхьаи ашьҭахьи.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ахархәарала РНК аиҟәыҭхаразы аҭыжьыҩ ипротокол шәықәныҟәа. Аҿырԥшы еиԥшны аҟаҵаразы QIAshredder (QIAGEN) ахархәара. Акомплементартә ДНК (кДНК) асинтез азы амч ду змоу РНК-кДНК-тәи акит (Thermo Fisher Scientific) ахархәара. Ухы иархәа TaqMan Рапид Адвансд Мастер Микс (Термо Фишер Саиентифик) гентә експресиа ашәагаа аилкааразы (аҭыжьыҩ ипротокол инақәыршәаны) абри аҩыза азондқәа рыла: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs0042A217 Hs02786624_g1 [глицеральдегид-3-фосфат офф гидроген (GAPDH)] и Hs01010726_m1 (SLC22A2). Аҿырԥштәқәа StepOnePlus аамҭа ҭакԥхықәралатәи ПЦР-системаҿы (Аппликациатә биосистемақәа) (Аппликациатә биосистемақәа) MicroAmp ирласу оптикатә 96-тәи ареакциатә плита аҿы (Аппликациатә биосистемақәа) MicroAmp оптикатә пленка ацҵаны еиҿкаан. Иарбанзаалак Ct аҵакы 35 еиҳау ҳәа иԥхьаӡоуп аԥшааратә ԥҵәа ахыхь, насгьы иԥшаам ҳәа иарбоуп.
Аԥхьа ишҳәаз еиԥш ЧИП анагӡара (58). Ажәакала, ахәыцқәа формальдегидла ирыцқьан (аҵыхәтәантәи аконцентрациа 1,42%), насгьы 10 минуҭк ауада аҳауа атемператураҿы иҭарҵон. Ухы иархәатәуп ацҵаратә буфер (25 мМ Hepes, 1.5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl and 0.1% NP-40) 10 минуҭк аҵаа аҿы, нас иммунопреципитациатә буфер аҿы ишҳәаз еиԥш еиҭаҵатәуп (58 ). Анаҩс ацәырҵра анаҩстәи ациклқәа рыла sonicated: 10 циклқәа (20 1-секундтәи импульсқәа) насгьы 40 секундтәи астатикатә аамҭа. Инкубировать ЧИП-градус иммуноглобулин G (Технология Сигнализации Целл; 1мкл), гистон Н3 (Технология Целл Сигнализации; 3мкл), NFAT (Инвитроген; 3мкл) и SP1 (Технология Целл Сигнализации; 3мкл) антитела с образцом sha°CC.overight Апротеин А ахәаӡқәа (Thermo Fisher Scientific) 4°C аҟны сааҭк ҟәымшәышәла ирҵысуа аҿырԥштәы ацҵаны инкубациа рзутәуп, нас ДНК абеиара азы ахелекс ахәаӡқәа (Био-Рад) рхы иадырхәоит, насгьы апротеин рыцқьаразы протеиназа К (Thermo Fisher) рхы иадырхәоит. ТНФα апромотора ПЦР ала иԥшаан: ԥхьаҟа, ГГГ ТАТ ССТ ТГА ТГС ТТГ ТГТ; аха, ГТГ ССА АСА АКТ ГСС ТТТ АТА ТГ (207-бп аалыҵ). Асахьақәа Image Lab (Bio-Rad) ала иҭнажьит, насгьы ImageJ апрограмматә еиқәыршәара ахархәарала рыԥхьаӡара мҩаԥган.
Ацеллюляртә культура асупернатант еизган хыхь ишҳәаз еиԥш. Аилкаара мҩаԥган ауаҩытәыҩсатә TNFα ELISA акит (Invitrogen), ауаҩытәыҩсатә IL-2 ELISA акит (Invitrogen), ауаҩытәыҩсатә IFN-γ ELISA акит (Abcam) рҭыжьыҩцәа рпроцедурақәа рыла. Аҭыжьыҩ ипротокол инақәыршәаны, асупернатант 1:100 еиҟараны иӡааҵан TNFα, IL-2 рыԥшааразы, 1:3 рыла IFN-γ рыԥшааразы. 450 нм аҟны абсорбциа ашәаразы EnVision 2104 Мультилабл Реадер (ПеркинЕлмер) ахархәара.
ПБМЦ еиҟәыҭханы иҟан леукоцитқәа реиҟәыҭхаратә алыҵқәа (STEMCELL Technologies) рҟынтәи Ficoll градиенттә ҵаӷаратә центрифугациала. CD3 + ацәеижьқәа PBMC аҟынтәи иалкаан CD3 ацәаҳәақәа (Miltenyi) рыла. МНК ыҟаны ма иҟамкәа, CD3+ ахәыцқәа 3 мшы рыҩныҵҟа CD3 (5мкг/мл), иҭәу CD28 (3мкг/мл) IL-2 (300 U/ml; Proleukin) рыла еиҿкаан. мшы рышьҭахь, ахәыцқәа еизганы 0,9% ҵаатәыҩсала ирыӡәӡәеит, насгьы апеллет ирҵааит. Ахәыцрақәа рыԥхьаӡара мҩаԥган ацәқәырԥаратә цитометриала (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигурациа) 123count eBeads ахархәарала.
Хыхь ишҳәаз еиԥш аметаболитқәа рыхгара. Ирҩаз аекстракт еиҭашьақәыргылан 4000 ацәеижьтә еиқәыршәара/мкл аконцентрациаҿы. Аҿырԥштәы анализ азутәуп еиҭасуа афазатә хроматографиала (1290 Инфинити II, Агилент Технологиқәа, Санта-Клара, CA) насгьы CORTECS T3 колонкала (2.1×150 мм, ахәҭаҷқәа ршәагаа 1.6-мкм, аԥсыӡқәа ршәагаа 120-Å; #186008500). Аполяртә массатә спектрометр (6470, Агилент), уаҟа аелектроспрейтә ионизациа позитивтә режимла аус ауеит. Еиҭаҵуа афаза А 0,1% форминтә ашьақар ауп (H2O аҿы), еиҭаҵуа афаза В 90% ацетонитрил, 0,1% форминтә ашьақар. LC градиент 0-2 минуҭ 100% А азы, 2-7.1 минуҭ 99% В азы, 7.1-8 минуҭ 99% В азы. . Аӡцара амҽхак 0.4мл/мин, насгьы аколонна акамера 50°C ахьӡаны ирԥхоит. МНА ахимиатә стандарт цқьа (М320995, Торонтотәи аҭҵааратә химиатә компаниа, Норт-Иорк, Онтарио, Канада) ахархәара аамҭеи аиҭакреи (РТ = 0.882 минуҭ, аиҭакра 1 = 137→94.1, аиҭакра 2 = 137→версиа→373) ашьақәыргыларазы. Ах-еиҭаҵрак зегьы ииашоу аныҟәгара аамҭазы ианыҟала, аиҭасра 1 ахархәара аиуеит ахаҭәаара азы, аҷыдара аиқәыршәаразы. МНА (Торонтотәи аҭҵааратә химиатә компаниа) стандарттә еиҵаҵа ҟаҵан 0.1, 1.0, 10 и 100 нг/мл стандартқәа раиуразы, 1.0 и 10мкг/мл ӡыхьтә стандартқәа раиуразы. Аԥшаара аҳәаа 1 нг/мл ауп, ацәаҳәатә ҭак 10 нг/мл инаркны 10мкг/мл рҟынӡа ауп. Ҩ-микролитрк рыла еиқәыршәоу аҿырԥштәыи астандарти аинжекциа зегьы LC/MS анализ азы ахархәара аиуеит, анализтә платформа аҭышәынтәалара азы еилаԥсоу ахаҭабзиара ахылаԥшратә ҿырԥштәы аа-инжекциак рзы еиҿкаауп. МНА-ла ихәышәтәыз ахәҭақәа зегьы рҭакқәа анализ ацәаҳәатә диапазон аҿы иҟан. Адыррақәа ранализ мҩаԥган MassHunter ахаҭәааратә анализтә программтә еиқәыршәара (v9.0, Agilent) ахархәарала.
Аҩбатәи абиԥара αFR-CAR аконструкциа аагоуп Song et al. (59). Иааркьаҿны иуҳәозар, аконструкциа иаҵанакуеит абри аҩыза аҵакы: CD8a лидертә еишьҭагыла, ауаҩытәыҩсатә αFR-спецификтә цепочка заҵәыктәи аҽеиҭакратә фрагмент, CD8a ацәаҳәа атрансмембрантә регион, CD27 ахәышәҭаҩныҵҟатәи адомен, CD3z ахәышәҭаҩныҵҟатәи адомен. CAR ашьҭанеира зегьы GenScript ала еиқәыршәан, насгьы аҩбатәи абиԥара лентивирустә експресиатә вектор ахь аклон ҟаҵан, GFP експресиатә кассета ахыхь, атрансдукциа аеффективра ахәшьара азы ахархәара аиоуит.
Лентивирус ҟаҵоуп HEK293T ахәыцқәа рыҭарала [Америкатәи акультура ахкы аизга (ATCC); 10% ацәаӷәаратә шьаҭа (FBS) 1% PenStrep злоу Дульбекко иԥсахыз Eagle амедиум аҿы еизҳауеит, насгьы CAR-GFP вектор ахархәара аиоуит, насгьы Апакеттә плазмидқәа (psPAX2 и pMD2.G, Addgene) липофекциатә амин (Sigma-Aldrich) рхы иадырхәоит. Авирус злоу асупернатант еизган атрансфекциа ашьҭахь 48, 72 сааҭ рышьҭахь, еилырхуан, насгьы ультрацентрифугациала еизыргеит. Авирустә супернатант -80°C аҟны иҵәахтәуп трансдукциа ҟалаанӡа.
ПБМЦ еиҟәыҭхоуп агәабзиара змоу адонортә леукоцитқәа реиҟәыҭхаразы аалыҵқәа (STEMCELL Technologies) Ficoll аградиенттә ҵаӷара ацентрифугациа ала. CD8+ ацәеижьқәа PBMC рҟынтәи рыхгара азы CD8 микроцәаҳәақәа (Miltenyi) рхархәара. Т-клеткақәа рстимуляциа ТрансАкт (Мильтени) ала, насгьы TexMACS амедиум аҿы [Мильтени; 3% аԥхарала инактивациа зызу ауаҩытәыҩсатә шьаҭа, 1% ПенСтреп, ИЛ-2 (300 У/мл) рыла иацҵоуп]. Астимуляциа ашьҭахь ҩажәиԥшь сааҭ анҵы, Т-хәыцқәа лентивирусла еиҭаргеит (10 мл концентрированный вирусный супернатант на 106 клеток). 1-3 мшы рышьҭахь Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+ аҿы) атрансдукциа аеффективра 30% иреиҵамкәа аарԥшразы ахәыцқәа р-GFP аҟазаара ахәшьара азутәуп.
CAR-T ацәеижьқәа 24 сааҭ рыҩныҵҟа Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep ацҵаны) аҿы абри аҩыза аҭагылазаашьақәа рҿы еиздырҳауан: ихәышәтәымкәа, 250 мкМ аденозин мамзаргьы 10 мМ МНК рыла ихәышәтәыз. Заанаҵтәи ахәшәтәра ашьҭахь, CAR-T ахәыцрақәа PBS ала ирыӡәӡәеит, насгьы 20,000 SK-OV-3 ахәыцрақәа [ATCC; 10% FBS еиԥш 1% PenStrep 10 рзы иацҵаны McCoy 5A амедиум аҿы (Sigma-Aldrich): 1 еффектори ахықәкытә рацио хынтә амплификациа азуын Immunocult амедиум аҿы. SK-OV-3 ацәеижьқәеи SK-OV-3 ацәеижьқәеи digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) рыла лизированны рхы иадырхәеит негативтәи апозитивтәи аконтрольқәа реиԥш. 24-тәи асааҭқәа рыла еицҿакны ақәаарыхра ашьҭахь, ацәеижь еизганы, лактатдегидрогеназа (LDH) ашәара мҩаԥган, уи аҭыжьыҩ иҟаиҵаз абжьгарақәа рыла (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH супернатант 1:50 LDH буфер аҿы иӡааҵан. Ашьра апроцент ршәеит абри аформула ала: ашьра апроцент = ариашара апроцент / ашьра апроцент х 100%, уа ариашара апроцент = акокультура-Т-хәыцқәа мацара, насгьы ашьра апроцент = апозитивтә контроль-негативтә контроль.
Атекст аҿы мамзаргьы аматериалқәеи аметодқәеи рҿы ишҳәоу еиԥш, астатистикатә анализ азы ахархәара ҟашәҵа GraphPad Prism 8, Microsoft Excel мамзаргьы R v3.6.0. Аӡәызаҵәык иҟынтәи аҿырԥштәқәа рацәаны еизгазар (асцит еиԥш, ашәра), ҳара ҳхы иаҳархәоит ҩыџьаратәи t-тест ма ачымаза ианаамҭоу еффектны линиартә ма зеиԥш модельк аҿы далаҳархәуеит. Аметаболомика анализ азы, аҵакы аԥышәа хынтәны имҩаԥысуеит.
Ари астатиа азы ацҵаратә материалқәа рзы шәахәаԥш http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1.
Ари иаарту анеирҭа змоу статьоуп, Creative Commons Attribution-Non-Commercial License аԥҟарақәа рыла ирылаҵоуп, уи иарбанзаалак амедиум ахархәара, аларҵәара, аиҭаҭыжьра азин анаҭоит, аҵыхәтәантәи ахархәара акоммерциатә феида азы акәымзар, насгьы аоригиналтә усумҭа иашазар. Азхьарԥш.
Агәынкылара: Ҳара шәара шәе-маил адрес шәҳәарц мацара ауп иҳаҳәо, адаҟьахь ишәыдышәкыло ауаҩы еиликаарц азы, е-маил ибарц шышәҭаху, насгьы уи спам шакәым. Ҳара е-маил адресқәак ҳҭакыӡом.
Ари азҵаара ахархәара амоуп уара уҭааҩу-уҭааҩу агәаҭаразы, насгьы автоматикала аспам ашьҭра аԥырҟәҟәааразы.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Г. Захариас (Лорен Г. Захариас), Абигеил Ели Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Бред Х. Расселс), Бред Х. Расселс (Джон Стагг), Бред Х. Џьонс Нельсон (Бред Х. Нельсон), Ральф Џь. (Рассел Г. Џьонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
МНА Т-хәыцқәа риммунтә супрессиа иацхраауеит, насгьы ауаҩы иканцер ахәышәтәраҿы иммунотерапиатә хықәкыс иҟоуп.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Г. Захариас (Лорен Г. Захариас), Абигеил Ели Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Бред Х. Расселс), Бред Х. Расселс (Джон Стагг), Бред Х. Џьонс Нельсон (Бред Х. Нельсон), Ральф Џь. (Рассел Г. Џьонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
МНА Т-хәыцқәа риммунтә супрессиа иацхраауеит, насгьы ауаҩы иканцер ахәышәтәраҿы иммунотерапиатә хықәкыс иҟоуп.
©2021 Аҭҵаарадырра аҿиаразы Америкатәи Ассоциациа. зегьы рзинқәа хьчоуп. АААС ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ХОРУС, КЛОКСС, КроссРеф, КАУНТЕР рпартниоруп. АҵарадырраАҿиарақәа ISSN 2375-2548.