Апротеинқәа реилыԥшаара асекретортә мҩаҿы ихымԥадатәиуп ахәҭақәа ркомпартментализациеи ргомеостаз аиқәырхаразы. Ацәаҟьа-бжьаҟазаратә еилыхра адагьы, асекретортә еиҭагара апроцесс аҿы кинезин аилыԥшаараҿы алипидқәа рроль акыр зхыҵуа хадаратә зҵаароуп, аха уи макьана аҭак амаӡам. Абра, ҳара 3D еицырзеиԥшу ԥштәырацәалатәи аамҭа-ҭагылазаашьаҿы асахьаҭыхра мҩаԥаҳгоит, ҿыц еиқәыршәоу агликозилфосфатидилинозитол-иммобилизированные протеины с очень длинными церамидными липидными моетиами являются кластерированными и классифицированы в специализированные эндоплазмы Net from usedmeme, that is. Уи адагьы, ҳара иааҳарԥшуеит, аендоплазматә ретикулумтә мембранаҿы иҟоу акерамид ацәаҳәа аура абри аилыԥшааратә селективразы ихадароу акы акәны ишыҟоу. Ҳҵара раԥхьаӡатәи ииашаны in vivo ашьақәырӷәӷәара аанарԥшуеит, алипидтә еизыҟазаашьақәа рыҩаӡара инақәыршәаны апротеинтә еидарақәа асекретортә мҩаҿы иалкаау аекспорттә ҭыԥқәа рахь рыхәҭаатәра.
Аеукариоттә хәыцрақәа рҿы аендоплазматә ретикулум (ЕР) аҿы еизгоу апротеинқәа асекретортә мҩала аныҟәгара аан еилырхуеит, иахәҭоу ахәыцрақәа рҭыԥ ахь рнагаразы (1). Ацәа-бжьаҟазаратә еилыхра анаҩсгьы, акыр ҵуан агәаанагара, липидқәак егьырҭ апротеинқәа рҟны еидкыланы, еиуеиԥшым амембранатә доменқәа рҿы еизганы, алхратә ҭыҵырҭақәаны иҟалар рылшоит ҳәа (2-5). Аха, уажәгьы иҟоуп ииашаҵәҟьаны in vivo ашьақәырӷәӷәарақәа, ари ҟалашьа змоу алипидқәа рҟны иҟоу амеханизм шьақәзырӷәӷәо. Ари ашьаҭанкылатәи апроблема аӡбаразы, ҳара ацәаҵаҿы иҭҵааит гликозилфосфатидилинозитол (ГПИ) анкертә протеинқәа (ГПИ-АП) ER аҟынтәи еиуеиԥшымкәа ишрышьҭуа. GPI-APs еиуеиԥшым алипидқәа ирыдҳәалоу ахәыцрақәа рықәыԥшылара апротеинқәа роуп ( 6, 7). ГПИ-АП – агликолипидтә ҟәша (ГПИ анкер) ала аплазматә мембран адәахьтәи абӷьыцқәа ирыдҳәалоу иалҵуа протеинуп. Урҭ GPI анкерқәа рыдыркылоит ER лумен аҿы аконсервативтә еиҭагара ашьҭахьтәи аиҭакрақәа реиԥш (8). Аиқәыршәара ашьҭахь, ГПИ-АП Гольджи иаппарат (5, 9) иалсны ER аҟынтәи аплазматә мембран ахь ииасуеит. ГПИ анкерқәа рыҟазаара иахҟьаны ГПИ-АП трансмембрантәи асекрециатә протеинқәа (егьырҭ аплазматә мембрантә протеинқәагьы уахь иналаҵаны) рҟынтәи хазы асекретортә мҩала ииасуеит (5, 9, 10). Аҳаҵәы ахәыцрақәа рҿы, GPI-APs егьырҭ иалҵуа апротеинқәа рҟынтәи еиҟәыҭхоуп аендоплазматә ретикулум аҿы, насгьы еиуеиԥшым авезикулақәа рҿы еиқәыршәоуп, урҭ еиқәыршәоуп апротеинтә комплекс II (COPII) ала (6, 7). ER аекспорттә процесс аҿы абри аклассификациа апроцесс шьақәзыргыло еилкаам, аха абри амеханизм азы алипидқәа аҭаххар ауеит ҳәа агәаанагара ҟаҵоуп, ҷыдала ГПИ анкер алипидтә хәҭа аструктуратә ремоделирование (5, 8). Аҳаҵаҿы, ГПИ алипидқәа рремоделирование алагоит ГПИ анырҿаԥшлак ашьҭахьҵәҟьа, насгьы акырынтә, уи ацерамид 26-карбонтәи ацәаҳәа еиҵыху ашәахтә ашьақар (С26:0) иадҳәалоуп (11, 12). С26 ацерамид иахьа уажәраанӡа аҵәырса ахәыцқәа ирҭрыжьуа ацерамид хада ауп. Уи ER аҿы еиқәыршәоуп, насгьы уи аиҳарак COPII авезикулақәа рыла Гольджи иаппарат ахь идәықәҵахоит (13). ГПИ-АП ER аекспорт ҷыдала иаҭахуп еиԥмырҟьо ацерамидтә синтез (14, 15), насгьы, Гольджи аппарат аҿы ацерамид инозитол фосфаттә церамид (IPC) ахь аиагара GPI анкертә синтез иадҳәалоуп (16). Аҟаҵатә мембранақәа рыла имҩаԥгаз биофизикатә ҭҵаарақәа иаадырԥшит, даараӡа иауу ацилтә рҳәынҵәаратә церамидқәа еидгыланы, еиуеиԥшым афизикатә ҟазшьақәа змоу еиҿкаау адоменқәа шьақәдыргылар шрылшо (17, 18). Абарҭ адыррақәа ирыбзоураны агипотеза ҟалоит, С26 ацерамид, насгьы ГПИ-АП С26 ацерамид рыцны рфизикатә ҟазшьақәа рхы иадырхәоит еиҿкаау аҭыԥқәа рахь мамзаргьы еилаҩашьоу ER мембрантә липидтә ҭагылазаашьаҿы иҟоу аҭыԥқәа рҿы еидгыларц азы. Еиҳарак еиқәыршәоуп икьаҿу, иҭәым аглицеролипидқәа (С16:1, С18:1) (19, 20). Ари арегионқәа ҷыдалатәи ER аҭыҵырҭақәа (ERES) рҿы рхы рзырхоит, уаҟа акерамиди ацерамид шьаҭас измоу GPI-AP-и Гольджиҟа еицныҟәгара ахьалшо COPII ҳәа изышьҭоу ацәаҳәаҿы (5).
Ари ҵараҿы, ҳара ишиашоу иԥаҳшәеит ари алипидтә механизм супер-резолюциатә конфокалтә аамҭа-ҭагылазаашьаҿы асахьаҭыхратә микроскопии (SCLIM) ахархәарала, уи иҿыцу микроскоптә техникоуп, уи аамҭаказы флуоресцентла иарбоу апротеинқәа рыхылаԥшра алшоит. (21, 22).
Ҳара раԥхьаӡа акәны SCLIM атехнологиа ҳхы иаҳархәеит, S. cerevisiae аҿы ER аанрыжь ашьҭахь трансмембрантә ҭыҵратә протеинқәа рҟынтәи анормалтә GPI-AP C26 ацерамидтә гәыԥ змоу еиҳа инарҭбааны аилкааразы. ER аклассификациа агәаҭаразы, ҳара ҳхы иаҳархәеит генетикатә система, ҿыц еиқәыршәоу аидара ERES in vivo иҭало ишиашоу асахьа ҭызхуа (7, 23). Аидара аҳасабала, ҳара иалҳхит C26 керамид шьаҭас измоу GPI-AP Gas1, аиаҵәаратә флуоресценттә протеин (GFP) ала иарбоу, насгьы трансмембрантә ҭыҵратә протеин Mid2, инфраҟаԥшь ааигәатәи афлуоресценттә протеин (iRFP) ала иарбоу, урҭ ҩбагьы аплазматә мембран ахь рхы дырхоит (24–26). sec31-1 атемпература-сенситивтә мутант аҿы, абарҭ аҩ-еидарак галактоза-индуцируемый промотор и конститутивный маркер ERES ҵаҟа иаарԥшуп. Аҳауа атемпература ӷәӷәаҿы (37°C), избан акәзар sec31-1 амутациа COPII ахҩа акомпонент Sec31 афункциа ианыруеит COPII аҿиареи ER аекспорти аанкыларазы, ҿыц еиқәыршәоу аидара ER аҿы еизоит (23). Атемпература лаҟә (24°C) аҟынӡа ианхьшәашәаха ашьҭахь, sec31-1 амутанттә хәыцқәа асекретортә ҭыԥ аҟынтәи еиҭашьақәгылеит, насгьы еизаз асинтетикатә еидара ҿыц ER аҟынтәи адәахьы адәахьы адәықәҵара иалагеит. CLIM визуализациа иаанарԥшит ҿыц еиқәыршәаз Gas1-GFP, Mid2-iRFP рыбжеиҳарак 37°C аҟны аинкубациа ашьҭахь sec31-1 амутанттә хәыцқәа р-ER аҿы ишеизҳауаз, нас 24°C аҟны 5 минуҭк рыла ишҭыҵыз (Асахьа 1). Mid2-iRFP ER мембран зегьы аҿы иахьеиқәыршәоу, насгьы Gas1-GFP еиԥҟьоу ER мембран аҭыԥ аҿы еизгоу, еизгоу азы, урҭ рыларҵәара зынӡа еиԥшым (Асахьа 1, А инаркны С рҟынӡа, насгьы Акино S1). Уи адагьы, асахьа 1D аҿы ишаабо еиԥш, Gas1-GFP акластер Mid2-iRFP амаӡам. Абарҭ аҭакқәа иаадырԥшуеит GPI-AP еиԥш трансмембрантә протеинқәа еиуеиԥшым ER мембрантә регионқәа рахь заанаҵ ишеиҟәыҭхаз. Gas1-GFP акластер mCherry's COPII coat protein Sec13 ҳәа зыхьӡу ERES ҷыдак иазааигәоуп (Асахьа 1, Е и F, насгьы акино S1) (23).
sec31-1 ацәеижьқәа галактоза-индуцированные секреции рныԥшуеит, ацилтә еиԥшьы еиҵыху (С26) ацерамид GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, аҵиаҵәа) иара убас трансмембрантә протеин Mid2-iRFP (TMP, аиаҵәа) насгьы ари Аконструктивтә ERES маркировка Sec13-mEScu азы magenta30 минуҭк рышьҭахь, 24°C ахь ииасит, насгьы SCLIM ала 5 минуҭк рышьҭахь асахьа ҭыхуп. (А инаркны С рҟынӡа) иаанарԥшуеит еидҵоу ма заҵәыктәи 2D асахьа аҳаирплан (А), 2D проекциатә сахьа 10 z-секциақәа (В) мамзаргьы 3D ацәеижьтә хемисфера асахьа аидареи ERES маркерқәеи (С). Скала 1мкм (А и В). Ашкала аиунит 0.551мкм (С) ауп. Gas1-GFP ԥшаан дискреттә ER регионқәа ма акластерқәа рҿы, Mid2-iRFP ԥшаан ER мембран (С) зегьы иалан. (D) Аграфик иаанарԥшуеит Gas1-GFP еиԥш Mid2-iRFP рфлуоресценциа аинтенсивра Gas1-GFP акластер аҿы ашәа шкәакәа ацәаҳәа (арӷьарахь) иаваргыланы. АУ, арбитрартә еизак. (Е и F) иаадырԥшуеит 3D асахьа, атауарқәеи ERES адыргақәеи еидызкыло. Gas1-GFP акластерқәа ҷыдалатәи ERES азааигәара иԥшаан. Ашкала аиунит 0.551мкм ауп. (F) Ашәа шкәакәа ӷәӷәа ERES иадҳәалоу Gas1-GFP акластер аанарԥшуеит. Агәҭантәии арӷьарахьтәии апанельқәа иаадырԥшуеит еидҵоу ирдуу 3D асахьа, насгьы иалху Gas1-GFP акластер еикәарҳәу ахәаԥшышьа.
Gas1-GFP акластери иҷыдоу ERES рыбжьара иҟоу иааигәоу аҭыԥтә еизыҟазаашьа иаанарԥшуеит Gas1-GFP алхратә ERES ахь анеира шалшо, уи Mid2-iRFP ER ааныжьразы ахархәара змоу алхратә ҟазшьа иеиԥшым. Ари алшара аӡбаразы, ҳара ERES аизыҟазаашьа ҳрыхәаԥшит акы-ҩба амаҭәахәқәа рзы мацара (Асахьа 2, А инаркны С рҟынӡа). Ҳара иаҳбеит ЕРЕСқәа реиҳарак (70%) еидарак хкык мацара шрымоу. 2С асахьа ҵаҟатәи асахьаҿы иаагоуп ERES ҩ-ҿырԥштәык, Gas1-GFP мацара змоу (Асахьа 1) мамзаргьы Mid2-iRFP мацара (Асахьа 2). Уи иеиԥшымкәа, ERES 20% ҟынӡа ҩ-еидарак ыҟоуп, урҭ ҭыԥк аҿы еиқәыԥсоит. Иԥшаан, ЕРЕСқәак (10%) ҩ-хкык рыла аидара шрымаз, аха урҭ еилыкка еиуеиԥшым аҭыԥқәа рҿы еиҟәыҭханы ишыҟаз. Убри аҟнытә, абри астатистикатә анализ иаанарԥшуеит, ER аекспорт аныҟала ашьҭахь, GPI-AP Gas1-GFP еиԥш трансмембрантә еидара Mid2-iRFP еиуеиԥшым ERES ҳәа ишеиҟәшо (Асахьа 2D). Аилыԥшааратә еффективра ԥасатәи абиохимиатә анализ (6) еиԥш аморфологиатә еилкаара (7) рыла даара еиқәшәоит. Ҳара иара убасгьы иаҳбар ҳалшоит ЕРЕС иҭало акарантинтә еидара аҟазшьа (Асахьа 2Е, Акино S2). 2Е асахьа иаанарԥшуеит Gas1-GFP (панель 3) мамзаргьы Mid2-iRFP (панель 4) рыхәҭак мацара ганкахьала ERES ишҭало, насгьы иалкаау аҭыԥ аҿы ишҭаку. 2Е асахьа апанель 5 иаанарԥшуеит Gas1-GFP еиԥш Mid2-iRFP зны-зынла еиԥшу ERES аҿы ишыҟоу, аха урҭ еиуеиԥшым ганқәа рҟынтәи иҭалоит, насгьы еиуеиԥшым COPII авезикулақәа раарԥшра зылшо еиуеиԥшым аҭыԥқәа рҿы еизгоуп. Ҳара иара убас ишьақәҳарӷәӷәеит, иаҳбаз аилыхреи аклассификациеи C26 керамид шьаҭас измоу GPI-AP Gas1 селективтә ERES ҳәа иҷыдоу, избан акәзар даҽа трансмембрантә секрециатә еидарак, GFP-tagged plasma membrane protein Axl2 (27 ), Mid2-iRFP еиԥшу аҟазшьа аазырԥшуа. (Асахьа S1, насгьы акино S3). Ҿыц еиқәыршәоу Axl2-GFP ER мембранала Mid2-iRFP еиԥш еиқәҵоуп (Асахьа S1, А и B), насгьы Mid2-iRFP еицҭыԥны иҟоуп ERES еиҳарак рҿы (Асахьа S1, B инаркны D рҟынӡа). Апанельқәа 1, 2 асахьа 1. S1C иаанарԥшуеит ҩ-трансмембрантә еидарак ахьеиқәыԥсо ERES ҩ-типтә ҿырԥштәқәак. Абас еиԥш иҟоу аҭагылазаашьақәа рҿы аҩ-тауаркгьы ERES еицҭалоит (Асахьа S1E, Апанель 3, Акино S3).
Агалактоза индукциа зызуа асекрециақәа, Gas1-GFP (GPI-AP, аҵиаҵәа) иара убас Mid2-iRFP (TMP, аиаҵәа) насгьы конститутивтә ERES маркировка Sec13-mCherry (ERES, магента) 37 °C ахь 30 минуҭ рҟынӡа асекрециа аҭыҵра ашьҭахь, °2 ахь 30 минуҭ блок, насгьы асахьа SCLIM ала 20 минуҭ рышьҭахь. (А инаркны С рҟынӡа) 2D проекциатә сахьақәа (А; ашкала абар, 1мкм) мамзаргьы 3D ахәҭатә хемисфера асахьа (В и С; ашкалатә еизак, 0.456мкм) аидареи ERES ала иарбоу 10 z-секциақәеи. (В) аҟны ҵаҟатәи апанельи (С) аҟны иҟоу апанельи иаарԥшуп аус зду асахьа, ERES (магента) [Gas1-GFP (аҵәа) и Mid2-iRFP (иаҵәа)] аҿы иҟоу амаҭәахәқәа мацара раарԥшразы. (В) Иаарту ажәҩа: ЕРЕС еидарак мацара ауп иаанаго (1 инаркны 4 рҟынӡа). Ашәақь ҟаԥшь: ERES иаҵанакуеит еиҟәыҭханы иҟоу аидара (5). Ашәақь шкәакәа: ERES еицыҟоу аидара зҭоу. Ҵаҟа: Иалху ERES заҵәык иаҵанакуеит Gas1-GFP (1) ма Mid2-iRFP (2) мацара. Амасштабтә ҵәҩан, 100 нм. (D) (C) аҿы иарбоу афотомикрографиа аԥхьаӡара. Еидарак мацара зҵазкуа ERES абжьаратәи апроцент (Gas1-GFP мамзаргьы Mid2-iRFP), еиҟәыҭханы иҟоу аидареи еиқәыԥсоу аидареи. Х-хьыԥшым ԥышәарак рҿы, n=432 54 ҳәаақәа рҿы. Агха ацәаҳәа = SD. Ҩ-мҵәыжәҩак змоу ҩыџьара змам t-тест. *** Р = 0,0002. (Е) 3D асахьа иалху ERES акарантинаҿы иҟоу аидара (С) ала иарбоу. Gas1-GFP (иаҵәа) (3) ма Mid2-iRFP (иаҵәа) (4) ганкахьала ERES (магента) иҭалоит, насгьы ERES аҩнуҵҟа ҭыԥ хәыҷык аҿы иҟоуп. Зны-зынла аидара аҩ-хкыкгьы ганк аҟынтәи ЕРЕС (5) ахь иҭалоит, насгьы ЕРЕС аҩнуҵҟа иалкаау ҭыԥк аҿы иҟоуп. Амасштабтә ҵәҩан, 100 нм.
Анаҩс, ҳара иԥаҳшәеит агипотеза, ER мембранаҿы иҟоу ацилтә еизыҟазаашьа еиҵыху акерамид (C26) Gas1 ҷыдалатәи акластеризациеи аилыхреи ERES ахь имҩаԥнагоит ҳәа. Убри азы ҳара ҳхы иаҳархәеит еиҭакыз ацәаҵаҵа GhLag1, уа ҩ-ендогентә церамидтә синтазақәа Lag1, Lac1 ԥсахын GhLag1 (аҟабҭҳәа Lag1 агомолог), уи ахылҿиаақәа рҿы ацәаҵаҵа ҟалеит, ахәыцратә мембран змоу ацәаҵаҵа Ceramide ацәаҵла абнатә хкы аасҭа икьаҿуп (Асахьа 3А) (28). Массатә спектрометриа (МС) анализ иаанарԥшит, абнатә хкы змоу аштаммқәа рҿы, ацерамид зегьы аҟынтәи 95% даара иауу (С26) ацәаҳәатә церамид, GhLag1 аҿы, ацерамид 85% даара иауу (С18, С16). ), 2% мацара ауп ацерамид даара иауу (С26) ацәаҳәатә церамид. Иахьа уажәраанӡа GhLag1 амембранаҿы иԥшааз ацерамидқәа С18, С16 ракәзаргьы, MS анализгьы ишьақәнарӷәӷәеит GhLag1 ашьаҭаҿы иаарԥшу Gas1-GFP GPI анкер C26 ацерамид шаҵоу, уи абнатә хкы змоу алипидқәа ирыҿырԥшуп. Ахаҭашьа еиԥшуп (Сурт 3А) (26). Убри аҟнытә, уи иаанагоит, акерамид аиҭашьақәыргыларатә ензим Cwh43 даараӡа иалнахуеит С26 акерамид азы, асахьа 26 аҿы ишаабо еиԥш, уи еиҳа иеиӷьны иаҵанакуеит ГПИ анкер маҷк С26 акерамид аҟынтәи GhLag1 ашьаҭаҿы. С2 (29). Ус шакәугьы, GhLag1 ахәҭаҷтә мембранаҿы еиҳарак C18-C16 ацерамид мацара ыҟоуп, Gas1-GFP акәзар, C26 ацерамид ыҟоуп. Абри афакт ари аштамм ER аҿы амембрантә керамид ацилтә рҳәынҵәа аура апроблема ҷыдала аӡбаразы идеалтәу мчыбжьыны иҟанаҵоит. Акласси аилыԥшаареи ргипотетикатә роль. Анаҩс, ҳара раԥхьаӡа иргыланы иҭҵааит C26 Gas1-GFP алшара аизгара акластерқәа рҿы GhLag1 атемпература-сенситивтә мутанттә аллел sec31-1 еиқәшаҳаҭратә флуоресценциатә микроскопи абзоурала, ER мембранаҿы еиҵыху (C18-C16) ацәаҳәа мацара ахьыҟоу Ceramide (Сурт 3). Ҳара игәаҳҭеит, sec31-1 аҿы, Gas1-GFP аиҳарак еизганы ишыҟаз, sec31-1 GhLag1 аҿы Gas1-GFP еиҵыху (C18-C16) еиҵыху акерамидтә ER мембран еиҳарак еизганы иҟамызт, насгьы ER мембран зегьы аҿы еиқәыршәан. Ииашаҵәҟьаны иуҳәозар, С26 акерамид шьаҭас измоу акластеризациа ERES ҷыдақәа ирыдҳәалоуп (Асахьа 1), анаҩс иҭаҳҵааит ари апроцесс ER аекспорттә протеин амеханизм афункциагьы алахәхар шалшо. GPI-AP ER аекспорт азы иҷыдоу COPII система ахархәоит, уи активла еиҿкаауп Ted1′s GPI анкер агликантә хәҭа аструктуратә ремоделирование ала (30, 31). Анаҩс арекомбинанттә GPI-гликан трансмембрантә еидара арецептор p24 акомплекс ала идыруеит, уигьы Lst1 алхны иаԥнаҵоит, уи COPII еидара еидызкыло асубединица Sec24 иҷыдоу изоформауп, GPI-AP-беиоу COPII Vesicles are necessary (33) шьақәнаргылоит. Убри аҟнытә, ҳара иаԥаҳҵеит ҩбатәи амутант, абарҭ апротеин заҵәыкқәа рыԥыхра еидызкыло (p24 комплекстә компонент Emp24, GPI-гликан ремоделирование анзим Ted1 и специфическая COPII субединица Lst1) sec31-1 мутанттә штамм, насгьы урҭ ҭаҳҵааит Is is it to form GFP1-clu3 (Figure). Ҳара иаҳбеит, sec31-1emp24Δ еиԥш sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP еиҳарак еиламгыланы, ER мембран зегьы аҿы ишышьҭоу, уаанӡа sec31-1 GhLag1 аҿы ишаҳбаз еиԥш, sec31-1lst1Δ аҿы, Gas1-GFP Sec3 еиԥш. Абарҭ аҭакқәа иаадырԥшуеит, ER мембранаҿы C26 ацерамид аҟазаара адагьы, Gas1-GFP акластеризациагьы p24 акомплекс иадҳәалар шахәҭоу, насгьы иҷыдоу Lst1 арекрутинг шаҭахым. Анаҩс, ҳара иҭаҳҵааит ER мембранаҿы иҟоу ацерамид ацәаҳәа аура Gas1-GFP p24 ахь аимадара еиҿкаара шалшо. Аха ҳара иаҳбеит, амембрана аҿы С18-С16 ацерамид аҟазаара p24 комплекс ала еиҭашьақәыргылоу ГПИ-гликанқәа (Асахьақәа S3, S4, А, В) мамзаргьы ГПИ-АП рыдҳәалареи ГПИ-АП аекспорти рзы анырра шамам. абаҩхатәра. Арекрут COPII субтип Lst1 (Асахьа S4C). Убри аҟнытә, С26 ацерамид-еиқәыршәоу акластеризациа еиуеиԥшым ER аекспорттә протеинтә механизмқәа рыла апротеинқәа реидҳәалара аҭахӡам, аха алипидқәа рыҩаӡара иахҟьаны еиҿкаау альтернативтә еилыхратә механизм адгылара анаҭоит. Анаҩс, ҳара анализ ҟаҳҵеит ER мембранаҿы иҟоу ацерамидтә ацилтә рҳәынҵәа аура Gas1-GFP селективтә ERES ҳәа еффективла аклассификациа азы аҵакы амазар. GhLag1 ацәаҳәа кьаҿ змоу ацерамид змоу Gas1 ER аанрыжьны аплазматә мембрана иахьҭало азы (Асахьа S5), ҳара ҳагәра ганы ҳаҟоуп, аилыԥшаара ацерамидтә ацилтә ацәаҳәа аурала имҩаԥысуазар, GhLag1 ацәаҳәа аҿы иҟоу Gas1 еиҭах амҩақәҵара аиур шалшо. ЕРЕС амаҭәахәқәа амембран еиԥшу.
(А) GhLag1 ахәҭаҷтә мембран еиҳарак еиҳа икьаҿу C18-C16 ацерамидқәа аҵоуп, аха Gas1-GFP ахәҭаҷтә GPI анкер уажәгьы абнатә хкы ахәҭақәа реиԥш C26 IPC амоуп. Хыхь: ацилтә еиԥшьы аура анализ ацерамид абнатә хкы (Wt) ацеллулозтә мембранаҿы, насгьы GhLag1p ашьаҭақәа масс-спектрометриала (MS). Адыррақәа иаадырԥшуеит ацерамид зегьы апроцент. Х-хьыԥшым ԥышәарак рыбжьаратәи. Агха ацәаҳәа = SD. Ҩ-мҵәыжәҩак змоу ҩыџьара змам t-тест. **** Р <0,0001. Ҵаҟатәи апанель: MS анализ ацилтә еизыҟазаашьа аура IPC Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI анкер аҿы иҟоу, абнатә хкы еиԥш GhLag1p аштаммқәа рҿы иаарԥшу. Адыррақәа иаадырԥшуеит иааизакны IPC асигнал апроцент. Зхы иақәиҭу хә-експериментк рыбжьаратәи. Агха ацәаҳәа = SD. Ҩ-мҵәыжәҩак змоу ҩыџьара змам t-тест. ns, акраҵанакуам. Р = 0,9134. (Б) Флуоресценциатә микрографқәа sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ и sec31-1lst1Δ ацәеижьқәа, галактоза-индуцированный Gas1-GFP аазырԥшуа ацеллы, инкубированы вниз 37°C до пассцепи 30 минут 24°C ашьҭахь. Ашәақь шкәакәа: ER Gas1-GFP акластер. Иаарту ашәа: Еилаӡам Gas1-GFP ER мембран зегьы аҿы еиқәыԥсоуп, ER характеристика змоу аныулеартә гьежь ашәыга аанарԥшуеит. Амасштабтә ҵәҩан, 5мкм. (В) (Б) аҿы иарбоу афотомикрографиа аԥхьаӡара. Апунктаттә Gas1-GFP структура змоу ахәыцқәа рыбжьаратәи апроцент. Х-хьыԥшым ԥышәарак рҿы, n≥300 ацәеижь. Агха ацәаҳәа = SD. Ҩ-мҵәыжәҩак змоу ҩыџьара змам t-тест. **** Р <0,0001.
Ари азҵаара ишиашоу аӡбаразы, ҳара GhLag1 аҿы Gas1-GFP, Mid2-iRFP SCLIM рвизуализациа ҟаҳҵеит sec31-1 атемпература-сенситивтә мутанттә аллел (Асахьа 4 насгьы Акино S4). ER 37°C аҟны иаанкыланы, анаҩс 24°C аҟны ианҭыҵ ашьҭахь, ҿыц еиқәыршәаз Gas1-GFP аиҳарак еизганы ER мембран зегьы иалаҵаны иҟамызт, еиқәыршәоу амикроскопқәа рыла ишаабо еиԥш (Асахьа 4, А, В ). Уи адагьы, ЕРЕС апроцент ду (67%) ҩ-хкык еицыҟоу аидарақәа аҵанакуеит (Асахьа 4D). 4С асахьаҿы 1-тәии 2-тәии апанельқәа рҿы иаагоуп ҩ-типтә ҿырԥштәык ERES еиқәыԥсоу Gas1-GFP еиԥш Mid2-GFP. Уи адагьы, аҩ-тауаркгьы еицырзеиԥшу ЕРЕС ахь иҭагалан (Асахьа 4Е, апанель 3, акино S4). Убри аҟнытә, ҳара ҳгәаҭарақәа иаадырԥшуеит ER мембранаҿы иҟоу ацерамидтә ацилтә рҳәынҵәа аура ER апротеин агрегациеи аклассификациеи рзы акыр зҵазкуа детерминантны ишыҟоу.
Sec31-1 GhLag1 галактоза-индуцированные секреции, Gas1-GFP (GPI-AP, зеленый) и Mid2-iRFP (TMP, зеленый) и конститутивные ERES-маркированные Sec13-mCherry (ERES, магента) Инкубировать при 37°C. минуҭк рыла еиҭаҵтәуп, 24°C ахь еиҵатәуп, ацәа ҭыҵырц азы, насгьы 20 минуҭ рышьҭахь SCLIM ала асахьа ҭыхтәуп. (А инаркны С рҟынӡа) 2D проекциатә сахьақәа (А; ашкала абар, 1мкм) мамзаргьы 3D ахәҭа ахемисфера асахьа (В и С; ашкалатә еизак, 0.45мкм) 10 z-секциақәа рҟынтәи, аидареи ERES-и рыла иарбоу. (В) аҟны ҵаҟатәи апанельи (С) аҟны иҟоу апанельи иаарԥшуп аус зду асахьа, ERES (магента) [Gas1-GFP (аҵәа) и Mid2-iRFP (иаҵәа)] аҿы иҟоу амаҭәахәқәа мацара раарԥшразы. (С) Ашәақь шкәакәа: ЕРЕС, атауарқәа реиқәыԥсара. Иаарту ашәа: ERES иаҵанакуеит елементк мацара. Ҵаҟатәи апанель: Иалху ERES еиқәыԥсоу амаҭәахәқәа амоуп (1 и 2) (С) аҿы иарбоу. Амасштабтә ҵәҩан, 100 нм. (D) (C) аҿы иарбоу афотомикрографиа аԥхьаӡара. sec31-1, sec31-1 GhLag1 аиунитқәа рҿы еидарак мацара (Gas1-GFP мамзаргьы Mid2-iRFP) алахәуп, насгьы еиҟәыҭханы иҟоу аидареи еиқәыԥсоу аидареи рзы ERES абжьаратәи апроцент. Х-хьыԥшым ԥышәарак рҿы, n = 432 54-тәи ахәыцрақәа рҿы (sec31-1) насгьы n = 430 47-тәи ахәыцрақәа рҿы (sec31-1 GhLag1). Агха ацәаҳәа = SD. Ҩ-мҵәыжәҩак змоу ҩыџьара змам t-тест. *** Р = 0,0002 (сек31-1) и ** Р = 0,0031 (сек31-1 ГхЛаг1). (Е) 3D асахьа иалху ERES еиқәыԥсоу аидара ацны (3) (С) аҿы иарбоу. Gas1-GFP (иаҵәа) еиԥш Mid2-iRFP (иаҵәа) ERES (магента) ганкахьала изааигәахоит, насгьы ERES ахьыҟоу аҭыԥ аҿы иаанхоит. Амасштабтә ҵәҩан, 100 нм.
Ари ҵара ииашаны in vivo ашьақәырӷәӷәарақәа аанагоит, алипидқәа рҟны иҟоу апротеинтә еидарақәа асекретортә мҩаҿы алхратә експорттә ҭыԥқәа рахь ишеихшоу, насгьы аклассификациа аселективразы ацилтә еизыҟазаашьа аура иамоу аҵакы ааирԥшуеит. SCLIM ҳәа изышьҭоу амч ду змоу, иҿыцу амикроскоптә техника ҳхы иархәаны, ҳара иааҳарԥшит ҿыц еиқәыршәоу Gas1-GFP (аплазматә мембран хада GPI-AP, ацилтә еизыҟазаашьа дуӡӡа змоу (C26) ацерамидтә липидтә хәҭа) ацәаҵаҿы) ER мембран (Асахьа 1). Уи адагьы, абарҭ аҩ-хкык еиуеиԥшым ЕРЕС-қәа рахь иалкааны иалалоит (Асахьа 2). Ацилтә еизыҟазаашьа ахәыцратә керамид амембрана аҿы еиҵахоит С26 инаркны С18-С16 ахь, Gas1-GFP акластер дискреттә ER регион ахь еиԥҟьоит, насгьы Gas1-GFP амҩа ԥсахуеит ER аанрыжьырц азы трансмембрантә протеин еиԥш ERES ала (Асахьа 3 насгьы Асахьа 3). 4).
GPI-AP ER аҭыҵразы иҷыдоу апротеинтә механизм ахархәоит, аха ҳара иаҳбеит C26 ацерамид-еиқәыршәоу аилыхра ERES аспециализациа ахь инагоу адифференциалтә протеинтә еидҳәаларақәа ишрықәымгәыӷуа (Асахьақәа S4, S5). Уи аҭыԥан, ҳара иҳаԥшааз адыррақәа алипидқәа рҟны иҟоу апротеинқәа реизгареи уи ашьҭахь егьырҭ аидарақәа рыҭгареи рыла еиҿкаау альтернативтә классификациатә механизм ацхраауеит. Ҳара ҳхылаԥшрақәа иаадырԥшуеит, Gas1-GFP регион ма акластер, ERES ҷыдак иадҳәалоу, трансмембрантә секреттә протеин Mid2-iRFP шамам, уи иаанарԥшуеит, C26 ацерамид-еиқәыршәоу GPI-AP акластер урҭ ERES ахь рыҩналара рзымарианы ишыҟанаҵо, насгьы уи аамҭазы, ари ҷыдалатәи аенскрециақәа TheFigure1 2). Уи иеиԥшымкәа, ER мембранаҿы C18-C16 акерамидқәа рыҟазаара GPI-AP арегионқәа ма акластерқәа аԥҵара иахҟьаӡом, убри аҟынтә урҭ трансмембрантә секрециатә протеинқәа еиԥшу ERES ахь иҭырцаӡом, мамзаргьы ирыԥсахӡом (Асахьақәа 3, 4). . Убри аҟнытә, ҳара иҳаԥхьаӡоит, С26 акерамид аиҟәыҭхараи аклассификациеи мҩаԥнагоит, ERES ҷыдақәа ирыдҳәалоу апротеинқәа реилаҵара арманшәаларала.
Ишԥаҟаҵатәу абри С26 акерамид-еиқәыршәоу акластеризациа ER ҷыдалатәи аҭыԥ аҿы? Амембрантә церамид аганахьала аҽеиҟәыҭхара атенденциа иахҟьаны, GPI-AP, C26 церамид еиҳа икьаҿу, еиҳа иҭәым аглицеролипидқәа зҵоу ER мембран еиҳа еиҿкаам алипидтә ҭагылазаашьаҿы еиҿкаау алипиддқәа рышьақәгылара иахҟьар алшоит. Ахаҭашьатә кластерқәа (17, 18). Аамҭалатәи акластер хәыҷқәа p24 акомплекс ианадҳәалак ашьҭахь еиҳа идуу, еиҳа иҭышәынтәалоу акластерқәа рахь еиҳагьы еилаҵазар рылшоит (34). Абри инақәыршәаны, ҳара иааҳарԥшит C26 Gas1-GFP p24 комплекси иареи реидгылара шаҭаху, еиҳа идуу иубаратәы иҟоу акластерқәа раԥҵаразы (Асахьа 3). p24 комплекс - ари еиуеиԥшым p24 трансмембрантә протеинқәа ԥшьба рыла ишьақәгылоу гетерозиготтә олигомеруп, уи амультиваленттә еидҳәалара еиқәнаршәоит, уи иахҟьаны GPI-AP акластер хәыҷқәа реимадара ҟалоит, убас ала еиҳа идуу Стабильтә кластер ҟалоит (34). ГПИ-АПқәа рыпротеинтә ектодоменқәа рыбжьара аидгыларагьы урҭ реизакра иацхраар алшоит, анҭарҵәыҵәқәа рполяризациатә епителиитә хәыцрақәа рҿы Гольджи рныҟәгараан ишаҳбо еиԥш (36). Аха ER мембранаҿы C18-C16 ацерамид аныҟоу, p24 комплекс Gas1-GFP ианадҳәалоу, хазы игоу акластер дуқәа ҟалаӡом. Иҵаҵӷәырку амеханизм ацилтә еимадара еиҵыху акерамид иҷыдоу афизикатәи ахимиатәи ҟазшьақәа ирыхҟьозар ауеит. Аҟаҵатә мембранақәа рбиофизикатә ҭҵаарақәа иаадырԥшуеит, ацилтә еимадара еиҵыху (С24) еиԥш, еиҵыху (С18-С16) ацилтә еимадаратә керамидқәа афазақәа реиҟәыҭхара рзаанагар шалшогьы, ацилтә еимадаратә церамидқәа (С24) рымацара роуп иҳараку ахәахәара аизырҳара зылшо, насгьы акиносахьа аиҭакразы. Аҩганктәи аизыҟазаашьақәа рыла (17, 37, 38). Иаарԥшуп TMED2 атрансмембрантә ҳеликс, Emp24 ауаҩытәыҩсатә гомолог, ацитоплазматә лобулақәа рҿы С18 акерамид шьаҭас измоу сфингомиелин еилыхны ишеидҳәалоу (39). Амолекуляртә динамика (МД) асимуляциақәа рыла, ҳара иаҳбеит С18, С26 акерамидқәа ҩбагьы Emp24 трансмембрантә ҳеликс ацитоплазматә лобулақәа ирыкәшо ишеизо, насгьы урҭ еиԥшу аԥыжәарақәа шрымоу (Асахьа S6). Иазгәаҭатәуп, уи иаанарԥшуеит, Emp24 атрансмембрантә ҳеликс амембрана аҿы алипидқәа асимметриатә еихшара иаанагар шалшо. Ари аԥстәқәа рыхәыцрақәа ирыбзоураны иҿыцу алҵшәоуп. Абас еиԥш иҟоу МД-симуляциақәа иаадырԥшуеит ефиртә липидқәа рыҟазаара (40) . Убри аҟнытә, ҳара ҳгәы иаанагоит, ER26 аҩ-лобулак рҿы иҟоу С26 ацерамид ҭыԥла ибеиоуп ҳәа. Алуминалтә лобулақәа рҿы ГПИ-АП ишиашоу амультиваленттә р24 ианадҳәалоу, насгьы ацитоплазматә лобулақәа рҿы р24 акәша-мыкәша С26 ацерамид аизгара, уи иацныҟәо Апротеин агрегациеи амембранатә еиҵаҟәаҟәара анацәкьарақәа рыла иҟалоит (41), убри аҟнытә ГПИ-АП еиҳау адценттә регионқәа рахь еиҟәыҭхоит, ER мембран арегионқәа (42). Уаанӡатәи аҳасабырбақәа иҟаҵаз амеханизм иадгылеит (43, 44). Аплазматә мембранаҿы олиголектинқәа, апатогенқәа ма акерамид шьаҭас измоу агликосфинголипидқәа (ГСЛ) антибодқәа рмультиваленттә еидҳәалара ГСЛ агрегациа ду аанарԥшуеит, афазақәа реиҟәыҭхара еиҳа иарӷәӷәоит, насгьы амембран адеформациеи аинтернализациеи ҟанаҵоит (44). Ивабучи егьырҭгьы.
Аԥстәқәа рполяризациа зызу епителиитә хәыцрақәа рҿы анти-Гольджи аҳа (ТГН) апикалтә плазматә мембран аҩаӡара аҟынӡа аконцентрациа ГПИ-АП аилыхреи аилыԥшаареи аконтроль азнауеит (10, 45). Ари агрегациа мҩаԥнагоит GPI-AP олигомеризациа (36), аха уи еиҳарак еиқәыршәазар ауеит ацерамидтә рҳәынҵәа аҵарҭыша аҿы иаҳԥыло. Аԥстәқәа р-ГПИ-АП ефиртә липидтә шьаҭа змоу анкер амазаргьы, уи ахимиатә еиҿкаара ацилтә еизыҟазаашьа дуӡӡа ацерамид еиԥшымзаргьы, аҵыхәтәантәи аҭҵаара иаанарԥшит аҩ-липидкгьы еволиуциала еиԥшу афизикатәи ахимиатәи ҟазшьақәеи рфункциеи шрымоу (40). Убри аҟнытә, анҭарҵәыҵәқәа рыхәыцрақәа рҿы иҟоу аетертә липидтә хәҭа аҵәырсаҿы иҟоу С26 ацерамид еиԥшхар ауеит, насгьы уи аҭакԥхықәра амембрана аҿы иҟоу ацәаҳәа ду змоу ацерамид аимадара ауп, GPI-AP агрегациеи аилыхреи рыцхрааразы. Ари алшара уажәгьы ишиашоу аԥышәара аҭахызаргьы, уаанӡатәи аԥшаарақәа ишьақәдырӷәӷәоит ацилтә еимадара еиҵыху ацерамид Гольджи ицәеижь ахь анагара ацитоплазматә еиҭагаратә протеинқәа рыла имҩаԥысӡом, аха уи ацәаҵа еиԥш иҟоу ГПИ анкерқәа рсинтез иадҳәалоуп ҳәа. Убри аҟнытә, аеволиуциатә консервативтә механизм еилыхны еицныҟәгара алшоит ацилтә еизыҟазаашьа дуӡӡа змоу акерамиди ГПИ-АПи (13, 16, 20, 46, 47) еицныҟәгаратә везикулак аҿы.
Аҳаҵәи аԥстәқәеи рполяризациа зызу епителиитә хәыцрақәа рсистемақәа рҿы, GPI-AP агрегациеи егьырҭ аплазматә мембрантә протеинқәа рҟынтәи аиҟәыҭхара зегьы ҟалоит ахәыцрақәа рықәыԥшылара аҟынӡа инеиаанӡа. Паладино еҭ. (48) иаадырԥшит, анҭарҵәыҵәқәа рполяризациа зызу епителиитә хәыцрақәа рТГН аҿы, ГПИ-АП акластеризациа ГПИ-АПқәа апикалтә плазматә мембран ахь алхратә классификациазы мацара акәымкәа, ГПИ-АПқәа рыкластеризациатә еиҿкаареи Уи абиологиатә усурақәеи еиҿнакаауеит. Ацелл аҿықә. Аҳаҵәы аҿы, абри аҵара иаанарԥшит, ER аҿы иҟоу C26 ацерамид-еиқәыршәоу GPI-AP акластер аплазматә мембран аҿы GPI-AP акластертә еиҿкаареи афункционалтә усуреи еиҿнакаар шалшо (24, 49). Ари амодель инақәыршәаны, GhLag1 ахәыцқәа аллергиа рымоуп GPI ингибиторқәа ма ахәыцқәа рыԥынҵа аинтегралра ианыруа ахәшәқәа (28), насгьы ацәеижьтә хәыцқәа реиқәшәараҿы ипроецируеижьҭеи акерамид ахәыц афункционалтә Gas1-GFP акластерқәа (49) рҭахра иаанарԥшуеит G hLa ахәыцқәа рфизиологиатә хҭысқәа. GPI-AP агха. Аха, анаҩстәи аԥышәарақәа, ахәыцрақәа рықәыԥшылара афункционалтә еиҿкаара ER аҟынтәи алипидқәа рыура шьаҭас измоу аилыԥшааратә метод ала ипрограммкума ҳәа, ҳԥхьаҟатәи ҳҭҵаарақәа рзы атема ауп.
Абри аус аҿы ахархәара зауз Saccharomyces cerevisiae ацәаҳәақәа рсиа ҟаҵоуп Аҭаӡҩыра S1 аҿы. MMY1583 и MMY1635 SCLIM ацәаҳәақәа зыԥсы ҭоу ахәҭақәа рҭыхразы еиқәыршәан W303 аҵаҟа. Абарҭ аштаммқәа Sec13-mCherry аазырԥшуа афлуоресценттә протеинтә тег аманы еиҿкаан полимеразтә еиԥшьратә реакциа (ПЦР) шьаҭас измоу аметод ахархәарала, pFA6a аплазмида шаблонс иҟаҵаны (23). GAL1 апромотора анапхгара аҵаҟа иҟоу афлуоресценттә протеин ала Mid2-iRFP аазырԥшуа аштамм абас еиԥш еиҿкаан. ПЦР амплификациа iRFP-KanMx ашьҭанеира pKTiRFP-KAN авектор аҟынтә (Е. О'Шиа аҳамҭа, Адген плазмида номер 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; аҭҵааратә ресурс аидентификатор (RRID): Адген_64687 ендоген Mid2-iRFP агеном ашьҭанеира амплификациа азуны GAL1 апромотораҿы аклон аныҟаҵаха ашьҭахь, уи аинтеграциатә плазмида pRS306 Not I-Sac I асаит ахь интеграциа азуын. Иалҵыз аплазмида pRGS7 Pst I ацны линеаризациа азуын URA3 локус ахь аинтеграциа азы.
Gas1-GFP аиларҵәаратә ген GAL1 апромотора анапхгара аҵаҟа ацентромер (CEN) аплазмидаҿы иаарԥшуп, уи абас еиԥш еиҿкаауп. Gas1-GFP ашьҭахьҟа амплификациа ҟаҵан PCR ала pRS416-GAS1-GFP аплазмида (24) (Л. Пополо аҳамҭа) аҟынтәи, насгьы CEN аплазмида pBEVY-GL LEU2 (C аҳамҭа) Xma I–Xho I аҭыԥ аҿы аклон ҟаҵан. Миллер; Адгентә плазмида аномер 51225; 51225; РРИД: Ацҵа_51225). Иалҵыз аплазмида pRGS6 ҳәа ахьӡҵан. Axl2-GFP аиларҵәаратә генгьы pBEVY-GL LEU2 авектор GAL1 апромотора анапхгара аҵаҟа иаарԥшуп, уи аргылара абас ауп. Axl2-GFP ашьҭахьҟа амплификациа ҟаҵан pRS304-p2HSE-Axl2-GFP аплазмида (23) аҟынтәи ПЦР ала, насгьы pBEVY-GL LEU2 авектор Bam HI-Pst I асаит аҿы аклон ҟаҵан. Иалҵыз аплазмида ахьӡҵан pRGS12. Ари ҭҵаара аҿы ахархәара зауз олигонуклеотидқәа реишьҭагыла аҭаӡҩыра S2 аҿы иаагоуп.
Аштамм 0,2% аденин, 2% агликоза [YP-декстроза (YPD)], 2% раффиноза [YP-раффиноза] злоу ацәаҵа аекстракт апротеин p (YP) абжьаратәи (1 % ацәаҵа аекстракт, 2% апротеин ept) рыла иацҵан. (YPR)] мамзаргьы 2% галактоза [YP-галактоза (YPG)] акарбон ахыҵхырҭа аҳасабала, мамзаргьы асинтетикатә минималтә ҭагылазаашьаҿы (0.15% ацәаҵа азоттә шьаҭеи 0.5% аммониумтә сульфат) ашьақар азы иаҭаху аминоацидқәеи ашьаҭақәеи рыцҵаразы, Иара убас 2% агликоза злоу (синтетикатә галактоза минималтә ҭагылазаашьа) акарбон ахыҵхырҭа аҳасабала.
Аамҭа ҭакԥхықәралатәи асахьаҭыхразы, GAL1 апромотора ҵаҟа аконструкциа аазырԥшуа атемпература-чувствительный sec31-1 мутанттә хәыцқәа YPR амедиум аҿы 24°C ҵхыбжьон лог-фаза абжьаратәи аҟынӡа иааӡан. YPG 24°C аҟны сааҭк рыла индукциа аныҟала ашьҭахь, ахәыцқәа 37°C аҟны 30 минуҭ рыла SG рҿы инкубациа рзуит, нас 24°C ахь ииаргеит, асекрециатә блок аҟынтәи иҭыҵырц азы. Конканавалин А ахархәан ахәыцқәа асаркьатә слаид аҿы рышьақәыргыларазы, насгьы SCLIM ала асахьа ҭыхразы. SCLIM - ари Olympus IX-71 инверттә флуоресценциатә микроскопи акомбинациа ауп (Hamamatsu Photonics) ×266.7 ҳәа аҵыхәтәантәи аизҳара змоу аблақәа рсистема аиқәыршәара алшоит, насгьы аелеқтронқәа ззырҳауа акамера (Hamamatsu Photonics) (21). Асахьа аиура мҩаԥысуеит еиқәыршәоу апрограмматә еиқәыршәара ала (Иокогава Електрик). 3D-тәи асахьақәа рзы, ҳара ҳхы иаҳархәеит еиҿкааны иҟаҵаз апиезоелектриктә усзуга, аобъективтә линза ҵәҩанҵәыла ирҵысырц азы, насгьы 100 нм еиҟәыҭханы оптикатә хәҭақәа еизаҳгеит еизганы. Z-стак асахьа 3D вокселтә данноқәа рахь ииаргоит, насгьы еикәарҳәуа адисктә конфокалтә микроскоп азы ахархәара змоу атеоретикатә ҭыԥқәа рыларҵәаратә функциа Volocity программтә еиқәыршәарала (PerkinElmer) адеконволиуциа аус адулара азы ахархәара аиуеит. Volocity апрограмматә еиқәыршәара ахархәарала автоматла ако-локациа анализ азы аҳәаа ашьақәыргыларазы, ERES аидарагьы уахь иналаҵаны ашәара мҩаԥган. Ацәаҳәа асканер анализ мҩаԥган MetaMorph апрограмматә еиқәыршәара (Molecular Devices) ахархәарала.
Астатистикатә ҵакы ашьақәыргыларазы GraphPad Prism апрограмматә еиқәыршәара ахархәара. Ҩ-мҵәыжәҩак змоу Студенттә t-тести аварианс анализ (ANOVA) атест азы, агәыԥқәа рыбжьара аиԥшымрақәа P <0.05 (*) анырра ду рымоуп ҳәа иԥхьаӡоуп.
Gas1-GFP афлуоресценциатә микроскопиеи азы, лог-фазатә хәыцқәа ҵхыбжьон YPD-да иааӡан, центрифугала еизганы, ҩынтә фосфаттә буфертә ҵаатәыҩсала ирыӡәӡәаны, 15 минуҭ раҟара аҵаа иқәҵаны, нас ԥыхьа ишҳәаз еиԥш микроскоп ҵаҟа имҩаԥысуан (Check24). Аиқәыршәаразы ахархәара аиуит Leica DMi8 амикроскоп (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) аобъективтә линза, L5 (GFP) афильтр, Hamamatsu акамера, Application Suite X (LAS X) апрограмматә еиқәыршәара рыла еиқәыршәоу. .
Аҿырԥштәқәа SDS аҿырԥштәы буферла 65°C 10 минуҭ рыла денатурирован, нас SDS-полиакриламидтә гельтә электрофорез ала (PAGE) еиҟәыҭханы. Иммуноблоттинг анализ азы, 10 мкл ацәырҵра мҩак аҿы иҭарҵеит. Аԥхьатәи антитело: аҭыӡшьа поликлональтә анти-Gas1 1:3000 еилаҭәаны, аҭыӡшьа поликлональтә анти-Emp24 1:500 еилаҭәаны, аҭыӡшьа поликлональтә анти-GFP (H. Riezman иҟынтә аҳамҭа) 1:300 еилаҭәаны ахархәара. Агәынаҳәа амоноклональтә анти-Pgk1 антитело 1:5000 еилаҭәаны ахархәара аиоуит (Џь. де ла Круз иҟынтәи аҳамҭа). Аҩбатәи антитело: Ахрен пероксидаза (HRP) еидҵоу ажь анти-ҭыӡшәа иммуноглобулин G (IgG) 1:3000 еилаҭәаны ахархәара аиоуит (Пирс). HRP-кониугированный коз анти-мышь IgG использовался при разбавлении 1:3000 (Пирс). Аиммунтә ҭак аҟаҵаратә зона ахылаԥшра мҩаԥган SuperSignal West Pico реагент (Thermo Fisher Scientific) ахемилуминесценциатә метод ала.
(31) аҿы ишҳәоу еиԥш, ибеиоу ER афракциаҿы иԥсабаратәу иммунопреципитациатә експеримент мҩаԥган. Ажәакала, 600 нм ( OD600) 100 опт. Уи асаркьатә хәырӡқәа рыла иԥыххааса ицон, анаҩс ацентрифуга ала ахәҭақәа рыԥҽыхақәеи асаркьатә хәырӡқәеи рықәгара мҩаԥысит. Анаҩс ацәеижь 17000 г 15 минуҭк 4°C аҟны ацентрифуга рҭарҵон. Апеллет еиҭа ТНЕ-ҿы иҭарҵеит, насгьы дигиталис сапонин 1% рҟынӡа аҵыхәтәантәи аконцентрациа аҟынӡа иацҵан. Асуспензиа сааҭк 4°C аҟны еикәарҳәны иҭарҵон, нас имӡӡо ахәҭақәа 13,000 г 4°C аҟны 60 минуҭ рыла центрифугала ирылхуан. Gas1-GFP иммунопреципитациазы, раԥхьаӡа аҿырԥштәы ҭацәу агарозтә хәырпыжәқәа (ChromoTek) рыла 4°C аҟны сааҭк рыла заанаҵ инкубациа рзутәуп, нас GFP-Trap_A (ChromoTek) рыла 4°C аҟны 3 ​​сааҭ рыла инкубациа рзутәуп. Иммунопреципитациа зызуыз ахәаӡқәа 0,2% дигоксигенин злоу ТНЕ-ла хәынтә ирыӡәӡәан, SDS аҿырԥштәытә буфер ала елуциа рзуын, SDS-PAGE аҿы еиҟәыҭханы, иммуноблоттинг ала анализ рзуын.
(31) аҿы ишҳәоу еиԥш, ибеиоу ER афракциаҿы аимадара аилкаара мҩаԥган. Ажәакала, ибеиоу ER афракциа 0.5 мМ дитиобис (сукцинимидил пропионат) (Пирс, Термо Фишер Саиентифик, Рокфорд, IL, USA; 20°C, 20 мин) ацҵаны инкубациа азуын. Аиқәԥаратә реакциа рцәеит глицин ацҵарала (50 мМ аҵыхәтәантәи аконцентрациа, 5 минуҭ, 20°С).
Ԥаса ишҳәаз еиԥш (50), MS анализ церамид абнатә хкы еиԥш GhLag1 штаммқәа рҿы имҩаԥган. Ажәакала, ахәыцқәа 30°C аҟны YPD аҿы експоненциалтә фаза аҟынӡа (3-4 OD600 унит/мл) еиздырҳауан, насгьы 25×107 ахәыцқәа ҭагалан. Урҭ рметаболизм атрихлорацеттә ашьақар ала идырцәоит. Аекстракциатә ӡҩага [етанол, аӡы, аетер, пиридин, 4,2 Н аммониум гидроксид (15:15:5:1:0,018 в/в)] ахархәара, насгьы 1,2 нмоль аҩныҵҟатәи стандарт С17 керамид (860517, Аванти поляртә липид) ахаҭабзиара). Аекстракт ԥсыҽу ашьақартә гидролиз амҩаԥгаразы монометиламинтә реагент [метанол, аӡы, н-бутанол, метиламинтә ӡҩара (4:3:1:5 v/v)] ахархәара, насгьы аӡы зҭәу н-бутанол ахархәара ацәа ацәгара азы. Аҵыхәтәаны, аекстракт еиҭаҵан позитивтә режимтә ӡҩага [хлороформ/метанол/ӡы (2:7:1) + 5 мМ аммониум ацетат] аҿы, насгьы масс-спектрометр ахь иҭарҵеит. Сфинголипидтә молекулақәа ралкаареи рыԥхьаӡареи рзы имҩаԥган амультиреакциатә мониторинг (МРМ). TSQ Vantage ахԥатәи аквадрупольтә массатә спектрометр (Thermo Fisher Scientific) алипидқәа ранализ азы роботтә нанофлоу ионтә хыҵхырҭа Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ала еиқәыршәоуп. Аиҿагыларатә енергиа акерамидтә категориа зегьы рзы оптимизациа азууп. MS данные были получены в позитивном режиме. Абиологиатә репликациа зегьы рзы, алипидтә сигнал х-шәагак рыбжьаратәи амедиана ауп.
(31) аҿы ишҳәоу еиԥш, Gas1-GFP аазырԥшуа ахәыцқәа (800×107) ԥсабаратә иммунопреципитациа рзыҟаҵан. Ирыцқьаз Gas1-GFP SDS-PAGE ала еиҟәыҭханы поливинилиденфлуорид (PVDF) мембранахь ииагахеит. Апротеин ааԥшит ПВДФ амид еиқәаҵәала ашәыга ала. Gas1-GFP абанда PVDF аҟынтәи иԥҟан, 5 раан аметанол ала, зныкгьы аӡыхьтә хроматографиа-MS (LC-MS) ҳәа изышьҭоу аӡала иӡәӡәан. Амембрантә ҭаӡ 500мл 0.3 М NaOAc (рН 4.0), абуфери 500мкл ҿыц иӡааху 1 М натриум нитрит еилаԥсоу 37°C аҟны 3 ​​сааҭ рыҩныҵҟа инкубациа азуны, алипидтә фракциа Gas1-GFP аҟынтәи иҭыҵуеит, насгьы инофаол иалҵуеит (51). Уи ашьҭахь, амембранатә стрип ԥшьынтә LC-MS градустә ӡыла иӡәӡәан, ауада атемператураҿы идырҩан, анализ ҟаҵахаанӡа -80°C аҟны азоттә атмосфераҿы иҵәахын. Аконтроль еиԥш, аԥышәара зегьы рзы ахархәара аиоуит ПВДФ мембран ҭацәу ацәырҵра. Анаҩс Gas1-GFP аҟынтәи иаагаз алипид MS ала анализ азуын, ишҳәаз еиԥш (50). Ажәакала, ГПИ-липид злоу ПВДФ ацәаҳәақәа 75 мкл негативтә хәаҷа-маҷа рыӡҩага [хлороформ/метанол (1:2) + 5 мМ аммониум ацетат] рҿы еиҭаҵан, насгьы електроспрей ионизациа (ЕСИ)-МРМ/МС анализ сфинголипид хкқәа (ТСК Vantage) ирхысит. Абри аҭагылазаашьаҿы, MS адыррақәа роуит негативтә ионтә режим аҿы.
Ԥаса ишҳәаз еиԥш, ГПИ анкер алипидтә хәҭа [3Н]-инозитол-маркированный ГПИ-АП (16) иалхын. Алипиды еиҟәыҭханы еиҿкаан хроматографиа ҵаӷала, ахәаахәҭратә система (55:45:10 хлороформ-метанол-0.25% KCl) ахархәарала, насгьы FLA-7000 (Fujifilm) ахархәарала рвизуализациа ҟаҵан.
Gas1-GFP (600×107) аазырԥшуа ахәыцқәа ҩынтәны ТНЕ-буферла ТНЕ-буферла ирыӡәӡәеит, насгьы ашәырӡтә ҟәырӷқәа рыла иԥыххааса, нас ацентрифуга рзыҟаҵан, ахәыцқәа рыԥхҭрақәеи ашәырӡтә ҟәырӷқәеи раныхразы. Нас ацәеижь 17000 г 4°C аҟны сааҭк рыҩныҵҟа ацентрифуга рҭарҵон. Апеллет ТНЕ-ла иӡәӡәан, 1 U PI-PLC (Invitrogen) 0,2% digitalis сапонин злоу ТНЕ-ла 37°C аҟны сааҭк рыҩныҵҟа иҭарҵон. Аензимтә ҟаҵара ашьҭахь, амембрана 17,000 г 4°C аҟны сааҭк рыҩныҵҟа ацентрифуга ала иаԥырхит. Gas1-GFP иммунопреципитациа азы, асупернатант GFP-Trap_A (ChromoTek) 4°C атемператураҿы ҵхыбжьон инкубациа азуын. SDS-PAGE ала еиҟәыҭхаз ирыцқьоу Gas1-GFP Coomassie бриллианттә шьацԥшшәыла ишәын. Gas1-GFP ашәыгатә бандоу аӡымҩангага иаарыкәыршоу ашәыга ҟаԥшь аҟынтәи иԥҟан, анаҩс иодоацетамид ала алкилирование ашьҭахь, дитиотреитол ала армаҷра ашьҭахь, атрипсин ала агель аҿы ахәышәтәра мҩаԥган. Атриптиктә пептидқәеи апептидқәеи ГПИ-гликанқәа рыла рыхгара, рҩара. Ирҩаз апептид 20 мл аӡаҿы иӡааҵан. LC ахь ахәҭак (8мкл) ҭажәгал. Октадецилсилан (ODS) колонка (Develosil 300ODS-HG-5; аҩныҵҟатәи адиаметр 150 мм×1.0 мм; Nomura Chemical, Аичи апрефектура, Япония) ахархәара аиоуит апептидқәа реиҟәыҭхаразы иҷыдоу аградиенттә ҭагылазаашьақәа рҿы. Еиҭаҵуа афаза ҳәа изышьҭоу ахәаахәҭҩы А (0,08% форминтәи ашьақар) насгьы ахәаҽыга В (0,15% форминтәи ацид 80% ацетонитрил аҿы). Аксела HPLC система (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ахархәан 55 минуҭ рыҩныҵҟа 50 мкл мин-1 5 минуҭ рыҩныҵҟа аӡҩыга А ацҵаны аколонна елиуциа азы, нас аӡҩыга В аконцентрациа 40% ахь еизырҳан. , Еиду Аштатқәа). Елуат еиԥмырҟьаӡакәа ЕСИ ионтә хыҵхырҭахь иҭарҵон, насгьы атриптиктә пептидқәеи ГПИ-гликанқәа змоу апептидқәеи LTQ Orbitrap XL (гибридтә линеартә ионтә трап-орбитраптә масс-спектрометр; Thermo Fisher Scientific) ала анализ рзуын. MS аиқәыршәараҿы, акапилляртә хыҵхырҭа агәымшәара 4,5 кВ еиқәыршәан, аиагаратә капилляртә температура 300°C еиқәыршәан. Акапилляртә напҟьареи атрубкатә линзатә напхгареи 15 В еиԥшны 50 В ҳәа ишьақәыргылан. MS данные были получены в положительном ионном режиме (разрешение 60,000; масса точность 10 частей в миллион) в масса диапазоне 300/м/з масса/заряд рацион (м/з) 3000. MS/MS данные получены через ионную ловушку в XLsbit first the [Or3 аиҿагылара иахылҿиааз адисоциациа (CID)].
MD симуляциақәа мҩаԥган GROMACS (52) апрограмматә еиқәыршәареи MARTINI 2 амчратә ҭыԥи (53-55) рыла. Анаҩс CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ахархәара аиуит диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) еиԥш Cer C18 мамзаргьы DOPC еиԥш Cer C26 злоу ҩ-шьаҭак аргыларазы. Cer C26 атопологиеи акоординатқәеи DXCE аҟынтәи иаагоуп, сфингозин аҵыхәа аҟынтәи иацҵаны иҟоу ахәаӡқәа раныхрала. Ҵаҟа иаагоу апроцесс ахархәара ҩбатәи ашьаҭа абаланс аиқәыршәаразы, насгьы асистема аҵыхәтәантәи акоординатқәа ахархәарала Emp24 зҵоу асистема аргыларазы. Ацәаҵа Emp24 атрансмембрантә домен (аԥсыбаҩқәа 173-193) α-спираль еиԥш еиҿкаан, визуалтә МД (ВМД) амыруга амолекуляртә структура ахархәарала (58). Анаҩс, еиқәыԥсаз алипидқәа анықәгаха ашьҭахь, апротеин ӷәӷәаны еиқәыршәаны, CHARMM GUI ахархәарала ҩ-шьаҭак ахь иҭарҵеит. Аҵыхәтәантәи асистемаҿы иҟоуп 1202 ДОПК, 302 Цер С26 мамзаргьы 1197 ДОПК, 295 Цер С18, Емп24. Аионизациа асистема 0.150М аконцентрациа аҟынӡа. Ҩ-шьаҭак змоу акомпозициақәа рзы ԥшь-репликак ҟаҵан.
Алипидтә ҩ-шьаҭак еиқәыршәоуп CHARMM GUI апроцесс ахархәарала, уи 405,000 шьаҿақәа рминимизациеи рбаланс аиқәыршәареи аҵанакуеит, уаҟа аҭыԥ аԥкрақәа ԥыҭ-ԥыҭла ирмаҷхоит, иагьықәгахоит, насгьы аамҭатә шьаҿа 0.005 ps инаркны 0.02 ps рҟынӡа еизҳауеит. Аеквивалентра ашьҭахь, уи 6 мкс ҭнаҵоит аамҭатә шьаҿа 0.02 ps аманы. Emp24 ҭагалара ашьҭахь, CHARMM GUI апроцесс ахархәара асистема аиҵатәреи абаланс аиқәыршәареи рзы, насгьы 8 с аҭыжьраҿы аус аутәуп.
Асистема зегьы рзы, абаланс аиқәыршәараан, ақәыӷәӷәара анапхгара азҭоит Берендсен ибаростат (59), насгьы ааглыхратә процесс аҿы, ақәыӷәӷәара анапхгара азиуеит Парринелло-Рахман ибаростат (60). Аҭагылазаашьақәа зегьы рҿы, абжьаратәи аҭагылазаашьа 1 бар ауп, насгьы абжа-изотроптә қәыӷәӷәара аиԥшьратә схема ахархәара аиуеит. Абаланс аиқәыршәареи аҭыжьреи рпроцесс аҿы, атермостат (61) ахархәара аиуеит апротеин, алипид, насгьы ахәаахәҭратә хәҭақәа ртемпература еиқәыршәаразы. Аоперациа зегьы аамҭазы, ахықәкытә температура 310К ауп. Аимадаратә еидҳәалара ԥхьаӡоуп 0.005 буфертә чҳара змоу Верлет исхема ахархәарала аиқәыршәаратә рсиа аԥҵарала. Куломб итермин ҳәаақәҵоуп ареакциатә ҭыԥи аԥҟаратә бжьаӡара 1,1 нм ахархәарала. Вандер Ваалс итермин 1,1 нм еиҟәыҭханы иҟоу аԥҟаратә схема ахархәоит, насгьы Верлет иԥҟаратә схема ахархәара аиуеит апотенциалтә дрифт азы (62).
ВМД ахархәарала, DOPC афосфаттә ҟәырӷқәа ма ацерамидтә AM1 ҟәырӷқәеи апротеини рыбжьара иҟоу ацәқәырԥа аҵарра 0,7 нм ауп, насгьы апротеин иадҳәалоу алипидқәа рхыԥхьаӡара ԥхьаӡоуп. Абри аформула ала, иԥхьаӡатәуп аԥсыҽра-абеиара (DE) афактор (63) аҟны ишаҳбо еиԥш: DE афактор = (апротеин аҿы иҟоу алипидқәа зегьы рхыԥхьаӡара 0.7) апротеин 0.7 аҟны (алипидқәа зегьы рҿы Cer рхыԥхьаӡара)
Аҳасабырбатә ҵакы абжьаратәи аҳасабала иаагоуп, насгьы агха амҳәырқәа SE ԥшь-копиак роуп. ДЕ-фактор астатистикатә ҵакы t-тест ала иԥхьаӡоуп [(averageDE-factor-1)/SE]. Иԥхьаӡатәуп Р аҵакы ҵыхәактәи ашара аҟынтәи.
GROMACS амыруга ахархәара аиуит ашьҭа аҵыхәтәантәи 250 нс рыҩныҵҟа Emp24 зҵоу асистема 2D латералтә ҭацәыратә карта аԥхьаӡаразы. Ацерамид абеиара/аԥсыҽра ахсаала аиуразы, Цер аҭацәра ахсаала еиҩшоуп Цер DOPC ахсаала еицҵаны, нас еиҩшоуп Цер ацәеижь аҿы иҟоу аконцентрациала. Аԥштәы еиԥшу ахсаала ашкала ахархәара аиуеит.
Ари астатиа азы иацҵоу аматериалқәа рзы шәахәаԥш http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1.
Ари иаарту анеирҭа змоу статьоуп, Creative Commons Attribution-Non-Commercial License аԥҟарақәа рыла ирылаҵоуп, уи иарбанзаалак амедиум ахархәара, аларҵәара, аиҭаҭыжьра азин анаҭоит, аҵыхәтәантәи ахархәара акоммерциатә феида азы акәымзар, насгьы аоригиналтә усумҭа иашазар. Азхьарԥш.
Агәынкылара: Ҳара шәара шәе-маил адрес шәҳәарц мацара ауп иҳаҳәо, адаҟьахь ишәыдышәкыло ауаҩы еиликаарц азы, е-маил ибарц шышәҭаху, насгьы уи спам шакәым. Ҳара е-маил адресқәак ҳҭакыӡом.
Ари азҵаара ахархәара амоуп уара уҭааҩу-уҭааҩу агәаҭаразы, насгьы автоматикала аспам ашьҭра аԥырҟәҟәааразы.
Софиа Родригес-Галлардо, Казуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валериа Зони (Валериа Зони), Ауксилиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес Лохихопе -Линеро), Уага), Мисако Арман (Мисако Арман), Миако Риман (Миако Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D-тәи аамҭа ҭакԥхықәралатәи асахьаҭыхра иаанарԥшуеит ацерамидтә еизыҟазаашьақәа рыҩаӡара алхратә ҭыҵратә ҭыԥқәа рҿы апротеинқәа реилыԥшааразы иамоу аҵакы.
Софиа Родригес-Галлардо, Казуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валериа Зони (Валериа Зони), Ауксилиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес Лохихопе -Линеро), Уага), Мисако Арман (Мисако Арман), Миако Риман (Миако Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D-тәи аамҭа ҭакԥхықәралатәи асахьаҭыхра иаанарԥшуеит ацерамидтә еизыҟазаашьақәа рыҩаӡара алхратә ҭыҵратә ҭыԥқәа рҿы апротеинқәа реилыԥшааразы иамоу аҵакы.
©2020 Аҭҵаарадырра аҿиаразы Америкатәи Ассоциациа. зегьы рзинқәа хьчоуп. АААС ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ХОРУС, КЛОКСС, КроссРеф, КАУНТЕР рпартниоруп. АҵарадырраАҿиарақәа ISSN 2375-2548.