Уажәтәи *Уажәтәи адрес: Кьолн 50931, Германиа, Кьолн Ажәра иадҳәалоу ачымазарақәа рҿы ацеллулартә стресс аҭак аҟаҵара иазку аҟазаратә кластер аҭҵаара (CECAD).
Амитохондриалтә чмазареи анеуродегенерациеи рхынҳәышьа амам ҳәа иԥхьаӡоуп, избан акәзар анеуронқәа рметаболизмтә пластичность ԥкуп, аха амитохондриатә дисфункциа ацәеижь аҿы анеуронтә метаболизм ахәҭақәа равтономиа иамоу анырра ибзианы еилкааӡам. Абраҟа ҳара еилаҳкаауеит амитохондриалтә еилаҵаратә динамика иахҟьаны еиҳа-еиҳа иӷәӷәахо OXPHOS азымхара змоу Пуркинье инеиронқәа рыхәҭа-спецификтә протеом. Ҳара иаҳбеит амитохондриалтә дисфункциа апротеомика аҿы иҵаулоу аԥсахрақәа шаанагаз, уи аҵыхәтәантәи аамҭазы ахәҭақәа ԥсаанӡа ииашоу аметаболизмтә программақәа еишьҭанеиуа аусура ишалагаз. Ҳзықәымгәыӷӡакәа, ҳара иаҳдырит еилыкка иҟоу аиндукциа пируват карбоксилаза (ПКх) егьырҭ ажәра иаҿагыло анзимқәа, ТСА ацикл абжьаратәи ахәҭақәа рыцҵара. PCx анкылара оксидативтә стресси анеуродегенерациеи еицәанатәит, уи иаанарԥшуеит атеросклероз OXPHOS змам анеуронқәа рҿы ахьчаратә еффект шамоу. Аҵыхәтәаны иԥхасҭахаз анеуронқәа рҿы амитохондриалтә еилаҵара аиҭашьақәыргылара урҭ аметаболизмтә ҟазшьақәа зынӡа иаԥсахуеит, убас ала ахәҭақәа рыԥсра аԥырхагахоит. Ҳара иҳаԥшааз адыррақәа иаадырԥшуеит уаанӡа изеилымкаауаз амҩақәа, амитохондриалтә дисфункциа аҿагылара рызҭо, насгьы иаанарԥшуеит анеуродегенерациа ачымазара аҵыхәтәантәи астадиақәа рҿыгьы еиҭаҵра шалшо.
Амитохондриақәа рроль хада анейронтә енергиа аметаболизм аиқәырхараҿы иазгәарҭоит ауаҩы имитохондриалтә чмазареи ирыдҳәалоу аневрологиатә симптомқәа рыла. Ачымазарақәа рӷьырак зыхҟьо амитохондриалтә генқәа рекспресиа еиҿызкаауа агенқәа рмутациақәа роуп (1, 2) ма амитохондриалтә динамика иадҳәалоу агенқәа рыԥхра, урҭ амитохондриалтә ДНК (мтДНК) аҭышәынтәалара иаԥырхагоуп (3, 4). Аԥстәқәа рмодельқәа рҿы имҩаԥгаз аусура иаанарԥшит, иаакәыршаны иҟоу ахәҭақәа рҿы амитохондриалтә дисфункциа аҭакс, аконсервативтә метаболизмтә мҩақәа (5-7) раарԥшра шалыршахо, уи акомплекстә чымазарақәа рпатогенез иҵауланы аилкааразы акыр зҵазкуа адыррақәа ҳнаҭоит. Уи иеиԥшымкәа, ахшыбаҩ амитохондриалтә аденозинтрифосфат (АТФ) аҟаҵара зеиԥш еиқәымшәара иахҟьаны иалкаау ахәҭақәа рметаболизмтә ԥсахрақәа ҳзеилкаара шьаҭанкылатәиуп (8), ачымазара аԥырҟәҟәааразы ма аԥырҟәҟәааразы ахархәара зылшо ахәшәтәратә хықәкқәа ралкаара шхымԥадатәиу азгәаҭаны. Анеуродегенерациа аԥырҟәҟәааразы (9). Аинформациа ахьмаҷу ҳәа иԥхьаӡоуп анервтә хәыцрақәа рыкәша-мыкәша иҟоу ахәыцрақәа рыхкқәа ирыҿырԥшуа аметаболизмтә еиҭакра даараӡа имаҷуп ҳәа иахьрыԥхьаӡо (10). Абарҭ ахәыцқәа асинаптикатә еимдара ацхрааразы, насгьы ааха аиуразы, ачымазарақәеи рҭагылазаашьақәа рҭак аҟаҵареи рзы анеуронқәа рахь аметаболитқәа рыла аиқәыршәараҿы хадаратә роль шынарыгӡо ҳхаҿы иаагозар, ахәыцқәа рметаболизм ахшыбаҩтә ткань иуадаҩу аҭагылазаашьақәа рҽыршьцылара алшара глиалтә хәыцқәа рҟны мацара ауп иахьыҟоу (11-14). Уи адагьы, ахшыбаҩ ахәҭақәа рҟны иҟоу ахәҭатә еиԥшымзаара еиуеиԥшым анеуронтә гәыԥхәыҷқәа рҿы ицәырҵуа аметаболизмтә ԥсахрақәа рыҭҵаараҿы акырӡа иаԥырхагоуп. Убри аҟнытә, анеуронқәа рҿы амитохондриалтә дисфункциа иахылҿиаауа ацеллулартәи аметаболизмтәи алҵшәақәа рзы маҷк ауп издыруа.
Амитохондриалтә дисфункциа аметаболизмтә хҭысқәа реилкааразы, ҳара Пуркинье инеиронқәа (ПН) еиуеиԥшым анеуродегенерациа астадиақәа рҿы иалҳхит, амитохондриалтә дәахьтәи амембранатә еилаҵара (Mfn2) аԥхасҭа иахҟьаны. Ауаҩы иҿы Mfn2 амутациақәа Charcot-Marie-Tooth тип 2A ҳәа изышьҭоу ҭынхалатәи амотортә сенсортә нейропатиа ахкы иадҳәалоуп (15), аха аҳәынаԥқәа рҿы Mfn2 аҭагылазаашьатә ԥхра ибзианы иазхаҵоу аоксидациатә фосфорилирование (OXthoPHOS) дисфункциа аиндукциа ауп. Еиуеиԥшым анеуронтә хкқәа (16-19) насгьы урҭ ирылҵуа анеуродегенеративтә фенотип еиҳа-еиҳа иӷәӷәахо аневрологиатә симптомқәа рыцуп, иаҳҳәап, аныҟәаратә еилахәарақәа (18, 19) ма ахшыбаҩ хәыҷы атаксиа (16). Акомбинациа ҳхы иархәаны, еиқәыршәам ахаҭәааратә (LFQ) протеомика, аметаболомика, асахьаҭыхра, авирологиатә методқәа, ҳара иааҳарԥшуеит апрогрессивтә нейродегенерациа ӷәӷәала ишыҟанаҵо пируваткарбоксилаза (PCx) егьырҭ афакторқәа рыла PNs артериосклероз in vivo Аензимқәа рцәырҵра. Ари ажәабжь аҵакы ашьақәырӷәӷәаразы, ҳара ҷыдала Mfn2-дефицит змоу PNs рҿы PCx аҟазаара еиҵаҳхит, насгьы иаҳбеит ари аоперациа аоксидативтә стресс еицәанатәуеит, анеуродегенерациа арццакуеит, убас ала азооспермиа ахәҭақәа рыԥсра шҳанаҭо шьақәҳарӷәӷәоит Аметаболизмтә адаптациа. MFN2 ӷәӷәала аҽаарԥшра иалшоит инагӡаны еиқәнархар атерминалтә дегенерациа PN ӷәӷәоу OXPHOS азымхара, амитохондриалтә ДНК рацәаны ахархәара, насгьы еиҟәыҷҷоу амитохондриалтә ҳәаа, уи еиҳагьы иаҵшьны иаанарԥшуеит, ари анеуродегенерациа ахкы ачымазара ԥхьаҟатәи астадиаҿы еиҭашьақәгылар шалшо.
Mfn2 нокаут PNs рҿы амитохондриақәа рсахьа ҭаҳхырц азы, ҳара ҳхы иаҳархәеит Cre-еиқәыршәоу амитохондриақәа ашәҭ флуоресценттә протеин (YFP) (mtYFP) (20) Cre рхықәкы анагӡара алзыршо аҳәынаԥ ашьаҭа, насгьы in vivo амитохондриалтә морфологиа гәаҳҭеит. Ҳара иаҳбеит PNs рҿы Mfn2 ген аԥхасҭа амитохондриалтә ҳәаа ԥыҭ-ԥыҭла аихшара ахь инагоит (Асахьа S1A), насгьы раԥхьаӡатәи аԥсахра 3 бжьышәҭак рзы иԥшаан. Уи иеиԥшымкәа, PN ахәыцрақәа рышьаҭа адегенерациа ду, Калбиндин иммуноокрашивание аӡра ишьақәнарӷәӷәо ала, 12 бжьышәа анхыҵуаз ауп ианалагаз (Асахьа 1, А, В). Амитохондриалтә морфологиаҿы раԥхьатәи аԥсахрақәеи иубаратәы иҟоу анеуронтә ԥсра алагареи рыбжьара аамҭа ахьеиқәымшәо ҳара ҳгәазҭанаҵеит ахәҭақәа рыԥсра аламҭалазы амитохондриалтә дисфункциа иахылҿиааз аметаболизмтә ԥсахрақәа рыҭҵаара. Ҳара иаԥаҳҵеит флуоресценциа-активациа змоу ахәҭақәа реилыԥшаара (FACS)-шьаҭас измоу стратегиа YFP (YFP+)-еилызкаауа PN аиҟәыҭхаразы (Асахьа 1С), насгьы анапхгаратә гәыҵхақәа рҿы (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), анаҩс CT1BRL (Асахьа) ҳәа изышьҭоу. YFP асигнал аизыҟазаашьатә интенсивра иаҵанакуа ашәхымс стратегиа аоптимизациа ҳара иҳалнаршоит YFP + ацәеижь (YFPhigh) PNs рыцқьара PNs ракәымкәа (YFPneg) (Асахьа S1B) мамзаргьы ԥхьаӡаратә флуоресценттә аксон / дендриттә фрагментқәа (YFPlow; Асахьа S1D, confopecal by microscopecal, left). Иалкаау апопуляциа ахаҭара ашьақәырӷәӷәаразы, ҳара LFQ протеомика мҩаԥаҳгеит, анаҩс ахәҭа хадақәа ранализ, насгьы иаҳбеит YFPhigh еиԥш YFPneg ахәыцрақәа рыбжьара еилыкка аилыхра шыҟоу (Асахьа S1C). YFPhigh ацәеижьқәа иаадырԥшит еицырдыруа PNs маркерқәа (иаҳҳәап, Calb1, Pcp2, Grid2 и Itpr3) рыбеиара (21, 22), аха нейронқәа рҿы мамзаргьы егьырҭ ацәеижь хкқәа рҿы еиҳарак иаарԥшу апротеинқәа рыбеиара ыҟамызт (Асахьа 1D) ). Зхы иақәиҭу аԥышәарақәа рҿы еизгаз иклассификациатәу YFPhigh ахәыцрақәа рҿы асамбльқәа реиҿырԥшра иаанарԥшит акорреляциатә коеффициент> 0.9, абиологиатә репликатқәа рыбжьара ибзиоу аҿиара аазырԥшуа (Асахьа S1E). Ажәакала, абарҭ адыррақәа ҳплан шьақәдырӷәӷәеит иҟаҵатәу ПН ҵартәи иҷыдоу аизоляциазы. Избан акәзар, ахархәара змоу L7-cre драйвертә система ахшара дызлоу ашьҭахьтәи актәи амчыбжь азы мозаикатә рекомбинациа ҟанаҵоит (23), ҳара CTRL аҟынтәи аҳәынаԥқәа рыхгара ҳалагеит, насгьы аҭагылазаашьатә (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Нейронқәа реизгара. Арекомбинациа анырхыркәшахалак ашьҭахь, 4-тәи абжьарак анырхыҵуа Mfn2cKO ҳәа иашьҭоуп. Аҵыхәтәантәи аҭагылазаашьа ҳәа, ҳара иалҳхит 8 бжьышәа рықәра, PN ашьаҭа еибганы ианыҟаз, еилкаау амитохондриалтә еиҟәыҭхара шыҟазгьы (Асахьа 1В насгьы Асахьа S1A). Иааидкыланы, ҳара еизакны 3013 протеин ҳрыԥхьаӡеит, урҭ рҟынтә 22% раҟара шьаҭас ирыман MitoCarta 2.0 аннотациақәа, амитохондриалтә протеом шьаҭас измоу амитохондриақәа ҳәа (Асахьа 1Е) (Асахьа 1Е) (24). 8-тәи абжьараҿы имҩаԥгаз адифференциалтә гентә експресиа анализ иаанарԥшит, апротеинқәа зегьы рҟынтә 10,5% мацара ауп аиҭакра дуқәа шрымаз (Асахьа 1F, Асахьа S1F), урҭ рҟынтә 195 протеин лаҟә-регулиациа рыман, 120 протеин ҩада-регулиациа рыман (Асахьа 1F). Иазгәаҭатәуп, абри адыррақәа реизга «инновациатә мҩа анализ» иаанарԥшуеит, еиуеиԥшымкәа иаарԥшу агенқәа еиҳарак иҷыдоу аметаболизмтә мҩақәа ргәыԥ ишаҵанакуа (Асахьа 1Г). Уи азы OXPHOS еиԥш иҟоу амҩақәа ррегулиациа аиҵатәра шьақәнарӷәӷәоит амитохондриалтә дисфункциа аиндукциа афузиа-дефициттә PNs рҿы, егьырҭ акатегориақәа, еиҳарак аминоацидтә метаболизм злахәу, еиҳа иӷәӷәоуп, уи амитохондриалтә метаболизм иақәшәоит P conwiring PN. адисфункциа.
(А) CTRL еиԥш Mfn2cKO аҳәынаԥқәа рыцеребеллартә ҟәша рхаҭарнакратә конфокалтә фотосахьақәа, PNs рыӡра еиҳа-еиҳа иӷәӷәаны иаазырԥшуа (calbindin, grey); нуклеусқәа DAPI рыла еиқәыршәан. (Б) Аԥхьаӡара (А) (варианс анализ ганкла, ***P <0.001; n = 4 6 х-ҳәынаԥк рҟынтәи агьежьқәа). (В) Аексперименттә усуратә еишьҭагыла. (D) Пуркинье (хыхь) иҷыдоу маркерқәа рԥхаратә карта рылаҵара, егьырҭ ахәҭақәа рыхкқәа (агәҭа). (Е) Венн идиаграмма, иалкаау ПН-аҿы иалкаау амитохондриалтә протеинқәа рхыԥхьаӡара аазырԥшуа. (F) 8-тәи абжьараҿы Mfn2cKO нейронқәа рҿы еиуеиԥшымкәа иаарԥшу апротеинқәа рволкантә график (1.3 аҵакы аҵыхәтәантәи ахә). (G) Аҟазаратә мҩа анализ иаанарԥшуеит 8 бжьышәҭак ҳәа ихәҭаку Mfn2cKO PN аҿы зегь реиҳа ихадоу хә-мҩак ҩадатәи (аҟаԥшь) насгьы ҵаҟатәи (аҵәа) амҩақәа. Иаарԥшуп иԥшаау протеинцыԥхьаӡа абжьаратәи аекспресиа аҩаӡара. Аԥхаратә карта ашәиаҵәа: ирҽеиу Р аҵакы. ns, акраҵанакуам.
Апротеомикатә дыррақәа иаадырԥшит I, III, IV акомплексқәа рыпротеинқәа рцәырҵра ԥыҭ-ԥыҭла ишмаҷхоз. Акомплексқәа I, III, IV зегьы мтДНК-код змоу ихадароу асубединицақәа рыла иҟан, аха нуклеартә код мацара змаз акомплекс II ҵаҵӷәыла анырра амамызт (Асахьа 2А, Асахьа S2А). . Апротеомика аҵыхәтәақәа инарықәыршәаны, ахшыбаҩ хәыҷы аҟәшақәа риммуногистохимиа иаанарԥшит, ПН аҿы IV комплекс акомплекс MTCO1 (митохондриалтә цитохром С оксидаза субединица 1) субединица аҩаӡара ԥыҭ-ԥыҭла ишылаҟәыз (Асахьа 2В). мтДНК-код змоу асубединица Mtatp8 ӷәӷәала еиҵахеит (Асахьа S2A), ануклеартә-код змоу АТФ синтаза субединица аҭышәынтәаларатә ҭагылазаашьа аҩаӡара ԥсахрада иаанхеит, уи мтДНК аҳәашьа ҭышәынтәалоу аамҭазы еицырдыруа аҭышәынтәалара змоу АТФ синтаза асубединица F1 иақәшәоит. Ашьақәгылашьа еишьашәалоуп. Аԥырҟара (7). Аамҭа-ҭагылазаашьаҿы полимеразтә еиԥшьратә реакциа (qPCR) ала еилыхыз Mfn2cKO PNs рҿы мтДНК аҩаӡара ахәшьара мтДНК акопиақәа рыԥхьаӡа ԥыҭ-ԥыҭла ишылаҟәуа шьақәнарӷәӷәеит. Аконтрольтә гәыԥ иаҿырԥшны, 8-тәи абжьарақәа рзы, мтДНК аҩаӡара 20% мацара ауп иаанхаз (Асахьа 2С). Абарҭ аҭакқәа инарықәыршәаны, Mfn2cKO PNs рконфокалтә микроскоптә шьҭаҵара ахархәан ДНК аарԥшразы, уи аамҭа иақәшәо ​​амитохондриалтә нуклеотидқәа рхархәара аанарԥшуеит (Асахьа 2D). Ҳара иаҳбеит, амитохондриалтә протеин адеградациеи астресс аҭакԥхықәреи ирылахәыз кандидатцәак мацара шракәыз, урҭ рҟны иҟоуп Lonp1, Afg3l2, Clpx, OXPHOS комплекстә еизгара афакторқәа. Апоптоз иалахәу апротеинқәа рҩаӡараҿы еиҳау аԥсахрақәа ԥшаамызт (Асахьа S2B). Убасҵәҟьа, ҳара иаҳбеит акальциум аныҟәгара иалахәу амитохондриақәеи аендоплазматә ретикулумтә каналқәеи рҿы аиҭакра маҷқәа шрымоу (Асахьа S2C). Уи адагьы, аутофагиа иадҳәалоу апротеинқәа рыхәшьараан еиҳау аԥсахрақәа рзыԥшаамызт, уи иммуногистохимиеи аелектронтә микроскопиеи рыла in vivo игәаҭоу аутофагосомақәа рыиндукциа иақәшәоит (Асахьа S3). Аха, PNs рҿы еиҳа-еиҳа иӷәӷәахо OXPHOS дисфункциа иацуп еилкаау ультраструктуратә митохондриалтә ԥсахрақәа. Амитохондриалтә кластерқәа 5-тәи 8-тәи абжьарақәа зхыҵуа Mfn2cKO PNs рыхәҭақәеи рдендриттә ҵлақәеи рҿы иубарҭоуп, насгьы аҩныҵҟатәи амембранақәа рструктура ӷәӷәала аԥсахрақәа аиуит (Асахьа S4, А, В). Абарҭ ультраструктуратә ԥсахрақәеи мтДНК ӷәӷәала аиҵахареи ирықәыршәаны, тетраметилродамин метил естер (ТМРМ) змоу ахшыбаҩ хәыҷқәа рҟәаҟәақәа анализ рзуны иаанарԥшит Mfn2cKO PNs рҿы амитохондриалтә мембрантә потенциал ӷәӷәала ишылаҟәыз (Асахьа S4C).
(А) ОКСФОС акомплекс аҳәаратә ҩаӡара аамҭа ацара анализ. 8-тәи абжьараҿы Р<0.05 змоу апротеинқәа мацара рызхәыцра (ҩ-мҩактәи АНОВА). Акәаԥ змоу ацәаҳәа: CTRL иаҿырԥшны ариашара ыҟам. (Б) Арӷьарахь: Анти-MTCO1 антитело зну ахшыбаҩ хәыҷы аҟәша аҿырԥштәы (аскалатә шьаҟа, 20 мкм). Пуркинье ихәҭақәа ааныркыло аҭыԥ ашәиаҵәа ала ихҩоуп. Арӷьарахь: MTCO1 аҩаӡарақәа рыԥхьаӡара (варианс анализ ганкла; n = 7 инаркны 20 рҟынӡа х-ҳәынаԥк рҟынтәи анализ зызуыз). (С) qPCR анализ мтДНК копии хыԥхьаӡара еилыхны PN (варианс анализ ганктәи; n = 3 7 мышқәа). (D) Армарахь: ДНК-ҿагыларатә антитело зну ахшыбаҩ хәыҷы аҿырԥштәы (аскалатә шьаҟа, 20 мкм). Пуркинье ихәҭақәа ааныркыло аҭыԥ ашәиаҵәа ала ихҩоуп. Арӷьарахь: мтДНК-тәи аԥхасҭақәа рыԥхьаӡара (варианс анализ ганкла; n = 5 инаркны 9 рҟынӡа х-ҳәынаԥк рҟынтә). (Е) Ацеребеллартә ҟәша ӷәӷәа аҿырԥштәы, mitoYFP + Purkinje ахәыцрақәа (ашәа) ахәыцрақәа зегьы рпатч-кламп аҭаҩраҿы иаазырԥшуа. (F) IV ахәы ақәҵара. (G) CTRL и Mfn2cKO Пуркинье рыхәыцрақәа рҿы адеполяризациатә токтә инжекциа ахаҭарнакратә ҭаҩрақәа. Хыхьтәи ашьҭа: АП зыхҟьаз актәи апульс. Ҵаҟатәи ашьҭа: Иреиҳау AP лассы-лассыра. (H) Апостсинаптикатә спонтантә ҭагаларақәа (sPSPs) рыԥхьаӡара. Ахаҭарнакратә ҭаҩратә мҩеи уи азум аизыҟазаашьеи аарԥшуп (I) аҟны. Аварианс анализ анализ азыруит n = 5 инаркны 20 рҟынӡа х-ҳәынаԥк рҟынтәи. Адыррақәа ргәыԥҵәага±SEM ҳәа иаарԥшуп; *Р<0.05; **Р<0,01; ***Р<0.001. (J) Перфорированный патч кламп режим ахархәарала иҭаҩу аспонтантә АП ахаҭарнакратә шьҭақәа. Хыхьтәи ашьҭа: Иреиҳау AP лассы-лассыра. Ҵаҟатәи ашьҭа: AP заҵәык азум. (К) Иԥхьаӡатәуп абжьаратәи амаксимумтәи АП лассы-лассыра (J) инақәыршәаны. Манн-Уитни иԥышәа; n = 5 ацәеижь анализ рзуын ԥшь-ҳәынаԥк рҟынтә. Адыррақәа ргәыԥҵәага±SEM ҳәа иаарԥшуп; ихадам.
8-бжьышәа зхыҵуа Mfn2cKO PN аҿы еилкаау OXPHOS ааха ааԥшит, уи иаанарԥшуеит анеуронқәа рфизиологиатә функциа ӷәӷәала ишеиқәымшәо. Убри аҟнытә, ҳара анализ ҟаҳҵеит OXPHOS-дефицит змоу нейронқәа рпассивтә електртә ҟазшьақәа 4-5 абжьарақәа рзы, 7-8 абжьарақәа рзы, ацеребеллартә ҟәаҟәақәа рҿы ацелл зегьытә патч-клампқәа рҭаҩрақәа ҟаҵаны (Асахьа 2Е). Ҳзықәымгәыӷӡоз ала, абжьаратәи аԥсшьаратә мембрантә потенциали Mfn2cKO нейронқәа рҭагалара аҿагылареи аконтроль еиԥшын, аха ахәҭақәа рыбжьара еиԥшымзаарақәак ыҟан (Таблица 1). Убасҵәҟьа, 4-5 бжьышәҭак рзы, ацәқәырԥа-аволтажтә еизыҟазаашьаҿы (IV ахәы) еиҳау аԥсахрақәа рзыԥшаамызт (Асахьа 2F). Аха 7-8 бжьышәҭак зхыҵуа Mfn2cKO нейронқәа IV режим (гиперполяризациатә шьаҿа) еиқәымхеит, уи иаанарԥшуеит аҵыхәтәантәи астадиаҿы агиперполяризациатә потенциал еилыкка ацәанырра шыҟоу. Уи иеиԥшымкәа, Mfn2cKO нейронқәа рҿы, еиҭаҟаларалатәи аусуратә потенциал (АП) ацәырҵрақәа ҟазҵо адеполяризациатә цәқәырԥақәа ибзианы ирычҳауеит, уи иаанарԥшуеит урҭ рцәырҵрақәа зегьы 8-бжьышәа зхыҵуа аконтрольтә нейронқәа рҟынтәи зынӡа ишеиԥшым (Таблица 1 и Асахьа 2Г). Убасҵәҟьа, аспотантә постсинаптикатә цәқәырԥақәа (sPSCs) рыласраи амплитудеи аконтрольтә гәыԥ иаҵанакуаз рыла еиҿырԥшуан, насгьы ахҭысқәа рыласра 4-тәи абжьарақәа рҟынтәи 5-тәи абжьарақәа рҟынӡа 7-тәи абжьарақәа рҟынтәи 8-тәи абжьарақәа рҟынӡа еизҳаит еиԥшҵәҟьа аизҳара аманы (Асахьа 2, H и I). ПН-қәа рҿы асинаптикатә ҟалара аамҭа (25). Абас еиԥш иҟоу аҭакқәа ҟаҵан перфорированные ПНс патчқәа рышьҭахь. Ари аконфигурациа ацеллулартә АТФ аграқәа ркомпенсациа аԥырхагахоит, ацеллулартә патч-кламп аҭаҩраан ишыҟалар алшо еиԥш. Хықәкыла, аԥсшьаратә мембрантә потенциали Mfn2cKO нейронқәа рспонтантә еихсра лассы-лассыреи рзы анырра ҟамлеит (Асахьа 2, J и K). Ажәакала, абарҭ аҵыхәтәақәа иаадырԥшуеит, еилкаау OXPHOS дисфункциа змоу PNs иҳараку афреквенциатә ҭырҭәааратә ԥштәқәа ибзианы ишрыхгатәу, уи иаанарԥшуеит анормалтә електрофизиологиатә ҭакқәа рыхьчара рылзыршо акомпенсациатә механизм шыҟоу.
Адыррақәа ргәыԥҵәага ± SEM (варианс анализ ганкла, Холм-Сидак ирацәаны аиҿырԥшратә тест; *P<0.05) ҳәа иаарԥшуп. Аиунит аномер ақәыргыламҭақәа рыла иарбоуп.
Ҳара ҳхы ҳақәҳаргылеит апротеомикатә дырраҭарақәа рҟны иҟоу категориак (Асахьа 1Г) OXPHOS ӷәӷәа ацәыӡ аҿагылара зылшо амҩақәа аҵанакуама ҳәа аҭҵаара, убас ала иҳаилҳаркаауеит анырра зауз PN еиҳа-еиҳа анормалтә електрофизиологиа зыхьчо (Асахьа 2, Е инаркны К рҟынӡа). . Апротеомикатә анализ иаанарԥшит, аҟәша змоу аминоацидқәа (BCAA) ркатаболизм иалахәу анзимқәа ӷәӷәала ишышьҭыхыз (Асахьа 3А, Асахьа S5A), насгьы аҵыхәтәантәи аалыҵ ацетил-КоА (CoA) ма сукцинил CoA актериосклероз аҿы атрикарбоксилатқәа рыцҵара шалшо (артериосклероз) аҿы. Ҳара иаҳбеит BCAA трансаминаза 1 (BCAT1) BCAT2 рыҩбагьы рыҟазаара еизҳаит. Урҭ BCAA катаболизм актәи ашьаҿа акатализ азыруеит α-кетоглутарат аҟынтәи аглутамат аизырҳарала (26). Аҟәшатә еизыҟазаашьа змоу акето-ацидтә дегидрогеназа (BCKD) акомплекс еиқәзыршәо асубединицақәа зегьы еиҳа еиӷьны еиҿкаауп (акомплекс катализаторс иамоуп BCAA акарбонтә скелет анаҩстәи ирхынҳәышьа змам адекарбоксилациа) (Асахьа 3А, Асахьа S5A). Аха, BCAA ахаҭа аҿы еилкаау ԥсахрақәак ԥшаамызт еилыхыз PN аҿы, уи зыхҟьо абарҭ ихадароу аминоацидқәа рыхәҭақәа рыҭара аизырҳара мамзаргьы даҽа хыҵхырҭақәак (агликоза ма алактиктә ацид) рхархәара TCA ацикл ахарҭәааразы (Асахьа S5B). OXPHOS змам PNs 8-тәи абжьарақәа рзы аглутамин аилаԥсареи атрансаминациатә усурақәеи еизҳауеит, уи амитохондриалтә ензимқәа аглутаминаза (GLS) насгьы аглутамин пируват трансаминаза 2 (GPT2) ррегулиациа аизырҳарала ианыԥшуеит (Асахьа 3, А, С). Иазгәаҭатәуп, GLS аҩадатәи арегулиациа еидҵоу изоформа глутаминаза С (GLS-GAC) мацара шакәу (Mfn2cKO/CTRL аԥсахра 4.5-тәи, P = 0.05), насгьы уи аканцертә тканьқәа рҿы иҷыдоу аҩаӡаратәи арегулиациа амитонергиондриалтә дгылара алшоит. (27).
(А) Аԥхаратә карта иаанарԥшуеит 8-тәи абжьараҿы иалкаау амҩа азы апротеин аҩаӡара аҽеиҭакра. (Б) Анти-PCx антитело зну ахшыбаҩ хәыҷы аҿырԥштәы (аскалатә шьаҟа, 20 мкм). Ашәақь ҟаԥшь Пуркинье ихәыцрақәа рцәеижь ахь иаанарԥшуеит. (С) Аамҭа ацо апротеинтә експресиа анализ атеросклероз азы акыр зҵазкуа кандидатс иалкаауп (мультипл t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 mice). (D) Хыхь: [1-13C]пируваттә трацер аҿы иҟоу акарбон аҭалара еиуеиԥшым амҩақәа аазырԥшуа асхематә диаграмма (иаҳҳәап, PDH ма транс-артериалтә мҩала). Ҵаҟа: Аскрипкатә график иаанарԥшуеит зныктәи акарбон (М1) аспартаттә ашьақар, ацитраттә ашьақар, амалитә ашьақар рахь ииасуа апроцент, ахшыбаҩ ӷәӷәа аҟәаҟәақәа [1-13С]пируват рыла анырҵалак ашьҭахь (ҩыџьаратәи t-тест; ** P <0.01). (Е) Иарбоу амҩа аамҭа аҭоурых зегь рыла анализ азура. 8-тәи абжьараҿы Р<0.05 змоу апротеинқәа мацара рызхәыцра. Ацәаҳәа ҵәаӷәа: ариашаратә ҵакы ыҟам (ҩ-ганктәи аварианс анализ; * Р <0.05; *** Р <0.001). Адыррақәа ргәыԥҵәага±SEM ҳәа иаарԥшуп.
Ҳара ҳаанализ аҿы, BCAA катаболизм хадаратә еиҿкааратә мҩақәа иреиуоуп. Ари афакт ӷәӷәала иаанарԥшуеит, ТСА ацикл иҭало аҳауацқьаратә ҭагылазаашьа ОКСФОС змам ПН аҿы аԥсахра шалшо. Ари анеуронтә метаболизм аиҭашьақәыргылара аформа хаданы иҟазар алшоит, уи анеуронтә физиологиеи аиқәхареи ишиашоу анырра рынаҭар алшоит OXPHOS дисфункциа ӷәӷәа ақәыргылараан. Ари агипотеза инақәыршәаны, ҳара иаҳбеит, хадаратә анти-атеросклеротикатә ензим PCx еиҳа ишыҭышәынтәалоу (Mfn2cKO/CTRL 1.5 раҟара аҽаԥсахуеит; Асахьа 3А), уи катализаторс иамоуп пируват оксалоацетат ахь аиагара (28), уи а9 ацәеижь аҿы иҟоуп ҳәа иԥхьаӡоуп. 30). Апротеомикатә ҵыхәтәақәа инарықәыршәаны, конфокалтә микроскопии иаанарԥшит PCx аекспресиа ҷыдала, насгьы еиҳаны ишеизҳаз OXPHOS-дефициттә PNs рҿы, PCx реактивра еиҳарак ааигәа иҟоу Бергман глиалтә хәыцрақәа рҟны мацара ишыҟаз (Асахьа 3В). PCx иаҳбаз апрегулирование функционалтә ԥышәаразы, ҳара ахшыбаҩ хәыҷы аҟәаҟәақәа [1-13C] пируваттә трацер ала ҳхәышәтәит. Пируват пируватдегидрогеназа (PDH) ала оксидтәны ианыҟала, уи изотоптә дырга ыӡит , Аха пируват ашьацҳәатә реакциақәа рыла аметаболизм аныҟало ТСА ацикл абжьаратәи ахәҭақәа рахь иалаҵоуп (Асахьа 3D). Ҳара ҳпротеомикатә дыррақәа рыдгылара азы, ҳара иаҳбеит абри ашьҭаҵага аҟынтәи маркерқәа рацәаны Mfn2cKO аҟәаҟәақәа рҟны аспартаттә ашьақар аҿы, ацитраттә ашьақари амалитә ашьақари ргьы абжьаратәи атренд рыман, аха ҵакы амамызт (Асахьа 3D).
Адопаминтә нейронқәа рҿы амитохондриалтә дисфункциа змоу МитоПарк агәыҵаҳәақәа рҿы, ҷыдала амитохондриалтә транскрипциатә фактор А ген (Тфам) ԥхасҭазтәуа агәыҵхақәа рдопаминтә нейронқәа рҿы (Асахьа S6B), PCx аекспресиагьы еиҳа иӷәӷәаны еиҿкаан (31), уи иаанарԥшуеит ацетонтә ашьақартә дисфункциа ду артериосклероз ОКСФОС ацәеижь аҿы. Иазгәаҭатәуп, артериосклероз иадҳәалоу анеуронқәа рҿы иааԥшуа иҷыдоу анзимқәа (32-34) ОКСФОС змам ПН-қәа рҿы еиҳа ишышьақәдыргыло, еиҳарак пропионил-КоА карбоксилаза (ПСС-А), Малонил-КоА митрионал-КоА мапропионил анзим 3 (МЕ3), зроль хада малат аҟынтәи пируват аиҭашьақәыргылара ауп (Асахьа 3, А, С) (33, 35). Уи адагьы, ҳара иаҳбеит Pdk3 анзим аҿы еизҳара ду, уи афосфорилациа азызуеит, убри ала PDH инактивациа азызуеит (36), PDH инактивациа азызуа Pdp1 анзим аҿы ма PDH анзимтә комплекс аҿы ԥсахрақәак ҳԥыхьамшәеит (Асахьа 3А). Еиқәшәаны, Mern2cKO PNs рҿы, Ser293 аҿы иҟоу PDH комплекс апируватдегидрогеназа Е1 ахәҭа α1 субединица α (PDHE1α) субединица афосфорилирование (PDH анзимтә усура аанкылара ҳәа идыруеит) еиҳа иӷәӷәахеит ( Асахьа S6C) (Асахьа S6C). Пируват ашьаҭанкылара амаӡам.
Аҵыхәтәан, ҳара иаҳбеит, серини аглицини рбиосинтез супермҩа, уи иадҳәалоу амитохондриалтә фолат (1С) ацикл, апролин биосинтез (Асахьа 1G, Асахьа S5C) зегьы еиҳа ишыӷәӷәоу, аҳасабырбақәа рыла, активациа апроцесс аамҭазы. Иаакәыршаны иҟоу ахәҭақәа амитохондриалтә дисфункциа рымоуп (5-7). Абарҭ апротеомикатә дыррақәа рыдгыларатә конфокалтә анализ иаанарԥшит, OXPHOS ахьыҟам PN аҿы, 8-бжьышәа зхыҵуа аҳәынаԥқәа рыхшыбаҩ ҟәаҟәақәа амитохондриалтә фолаттә цикл аҟны ихадоу анзим серин гидроксиметилтрансфераза 2 (SHMT2) рхы иадырхәеит. Ихадоу иммунтә ҭак (Асахьа S5D). CU-glucose-incubated acute cerebellar slices рҿы, аметаболизмтә шьҭаҵаратә експериментқәа иҵегьы ишьақәдырӷәӷәеит серини апролини рбиосинтез аизырҳара, уи иаанарԥшуеит акарбон изоформақәа серини пролини рахь рылаҵара еизҳаны ишыҟоу (Асахьа S5E). GLS еиԥш GPT2 рыла еиҿкаау ареакциақәа аглутамин аҟынтәи аглутамат асинтез азы аҭакԥхықәра рыдуп, насгьы аглутамат α-кетоглутарат рыбжьара атрансаминациа рзы, урҭ ррегулиациа иаанарԥшуеит OXPHOS-дефицит змоу нейронқәа аглутамат рҭахра еиҳаны ишрымоу, Уи зызку еизҳаз проурелин биосинтез ахьчара ауп (Асахьа5). Абарҭ аԥсахрақәа рҿырԥштәы ала, PN-спецификтә Mfn2cKO аҳәынаԥқәа рҟынтәи ацеребеллартә астроцитқәа рпротеомтә анализ иаанарԥшит, абарҭ амҩақәа (антипероксидазақәа зегьы нарылаҵаны) рҽырыԥсахуамызт, убас ала иаанарԥшуеит Ари аметаболизмтә мҩақәҵара селективуп деградациа зызу DN ахь (Сурт S6, S6).
Ажәакала, абарҭ анализқәа иаадырԥшит ПН-қәа рҿы еиуеиԥшым аметаболизмтә мҩақәа раамҭалатәи активациа ахсаалақәа. Анормалтәым анеуронтә митохондриалтә функциа раԥхьатәи атеросклерози 1С ремоделированиеи рахь инанагар алшоит (Асахьа 3Е, Асахьа S5С), насгьы I, IV комплексқәа рцәырҵраҿы ԥхьаҟатәи аԥсахрақәа ҟаларгьы, серин де ново асинтез аҿы аԥсахрақәа ҟалоит. OXPHOS дисфункциа (Асахьа 3Е насгьы Асахьа S5C). Абарҭ аԥшаарақәа иаадырԥшуеит еишьҭанеиуа апроцесс, астресс иахылҿиаауа амитохондриалтә (1С ацикл) ацитоплазматә (серинтә биосинтез) рҭак синергетикала ТСА ацикл аҿы атеросклероз аизырҳара анеуронтә метаболизм аиҭакразы.
8-бжьышәа зхыҵуа OXPHOS-дефицит змоу ПН-қәа ирылшоит еиҳа-еиҳа лассы-лассытәи агәыҭҟьаратә усура рыхьчар, насгьы амитохондриалтә дисфункциа рхарҭәааразы еиҳау аметаболизмтә еиҭеидҳәалара рхыргоит. Ари аартра иаанарԥшуеит аинтерес зҵоу алшара, уажәазыгьы, урҭ ахәыцқәа анеуродегенерациа аанкыларазы ма аԥырҟәҟәааразы ахәшәтәратә ҽалахәра роур шалшо. Ахьшәа. Ҳара ари алшара ҳаӡбеит ҩ-хьыԥшым интервенциак рыла. Актәи аметод аҿы, ҳара Cre-еиқәыршәоу адено-ассоциациатә вирус (AAV) вектор ҳаԥҵеит, MFN2 OXPHOS-дефициттә PNs in vivo рҿы еилыхха иаарԥшхартә еиԥш (Асахьа S7A). ААВ, код ҟазҵо MFN2, насгьы афлуоресценттә репортертә ген mCherry (Mfn2-AAV) еиқәыршәан раԥхьатәи анейронтә культурақәа рҿы in vitro, уи иахҟьаны MFN2 Cre-еиқәыршәоу амҩала аарԥшра ҟалеит, насгьы амитохондриалтә морфологиа еиқәнархеит, убас ала Mfn2, B нейронқәа рҿы аневромутациа аԥырхагахеит ( D Figure S7). Анаҩс, ҳара имҩаԥаҳгеит in vivo аԥышәарақәа 8-бжьышәа зхыҵуа Mfn2-AAV стереотактически анагаразы Mfn2cKO ахшыбаҩтә кортекс ахь, насгьы аныҟәгаратә ҳәынаԥқәа, анализ ҟаҳҵеит 12-бжьышәа зхыҵуа аҳәынаԥқәа (Асахьа 4А). Ихәышәтәыз Mfn2cKO аҳәынаԥқәа ԥсит (Асахьа 1, А и В) (16). Авирустә трансдукциа in vivo иахҟьаны PN алхратә експресиа ҟалеит еиуеиԥшым ахшыбаҩ хәыҷқәа рҿы (Асахьа S7, G и H). mCherry (Ctrl-AAV) мацара аазырԥшуа аконтрольтә ААВ аинжекциа Mfn2cKO аԥстәқәа рҿы анеуродегенерациа аҩаӡараҿы еиҳа анырра амамызт. Уи иеиԥшымкәа, Mfn2-AAV ацхыраарала еиҭарго Mfn2cKOs ранализ иаанарԥшит PN ахәҭа ашьаҭа ахьчаратә еффект ду (Асахьа 4, В, С). Хықәкыла, анеуронқәа рыҭбаара аныҟәгаратә ԥстәқәа иреиԥшымкәа иҟоуп (Асахьа 4, В, С, насгьы Асахьа S7, Н, I). MFN1 аҳәара, аха MFN2 акәымкәа, еиԥшны ахәарҭа аанагоит анеуронтә ԥсра аиқәырхараҿы (Асахьа 4С насгьы Асахьа S7, C, F), уи иаанарԥшуеит ектопиатәи MFN1 аҳәара MFN2 ацәмаҷра хра злоу ахарҭәаара шалшо. PN заҵәыктәи аҩаӡараҿы анаҩстәи анализ иаанарԥшит Mfn2-AAV еиҳарак амитохондриақәа рультраструктура шеиқәнархаз, мтДНК аҩаӡарақәа рнормализациа шыҟанаҵаз, насгьы антиангиогенезтә маркер PCx иҳараку аҳәаақәа шрызнеиз (Асахьа 4, С инаркны Е рҟынӡа). Еиқәырхаз Mfn2cKO аҳәынаԥқәа аԥсшьара аҭагылазаашьаҿы лабҿабатәи агәаҭара иаанарԥшит рҟазаареи рмотортә симптомқәеи (S1 инаркны S3 рҟынӡа аныҟәара) шеиӷьхаз. Аҵыхәтәаны, абарҭ аԥышәарақәа иаадырԥшуеит, OXPHOS ӷәӷәала иагу PNs рҿы MFN2 еиҭа алагалара аамҭа мтДНК ахархәара аиҭарсреи атеросклероз аизырҳареи рзы ишазхо, убас ала аксонқәа рыԥсыҽхара, насгьы анеуронтә ԥсра in vivo аԥырҟәҟәааразы.
(А) Асхема, иарбоу аметаболизмтә мҩа аус анауа аамҭазы, MFN2 еиқәзыршәо ААВ аинжекциа аексперименталтә график аазырԥшуа. (Б) 12-бжьышәа зхыҵуа ахшыбаҩ хәыҷы аҟәаҟәақәа рхаҭарнакратә конфокалтә сахьақәа, 8-бжьышәа рзы Mfn2cKO аҳәынаԥқәа рҿы еиҭаргоу, анти-Калбиндин антитело рыла иарбоу. Арӷьарахь: Аксонтә фибрқәа рмасштаб. Аксон зум ашкала 450 и 75 мкм ауп. (С) Арӷьарахь: ААВ атрансдукциатә цикл аҿы Пуркинье ихәҭақәа рыҭбаара аԥхьаӡара (ААВ +) (варианс анализ ганкла; n = 3 мыш). Арӷьарахь: мтДНК фокус анализ трансдуцированного PN в неделе 12 (непарный t-тест; n = 6 клеток из х-мышей). * Р <0.05; ** Р <0.01. (D) Иарбоу авирустә векторқәа рыла еиҭарго Mfn2cKO ахшыбаҩ хәыҷы аҟәша PNs рхаҭарнакратә еиҭагаратә електронтә микрографқәа. Аԥштәы ҟаԥшь змоу амаска иаанарԥшуеит адендритқәа ахьынхо аҭыԥ, насгьы акәаԥ еиқәаҵәа змоу аквадрат арӷьарахьтәи азум аанарԥшуеит; n иаанарԥшуеит абираҟ. Амасштабтә ҵәҩан, 1мкм. (Е) иаанарԥшуеит 12-тәи абжьараҿы еиҭарго PN аҿы PCx ашәыга аҿырԥштәы. Амасштабтә ҵәҩан, 20мкм. ОЕ, мыцхәы аҳәара; FC, аԥсахра аиҭакра.
Аҵыхәтәаны, ҳара иҭаҳҵааит OXPHOS дисфункциа змаз PNs рҿы пероксидаза-индуцированное клеточное выживание аҵакы. Ҳара mCherry еиқәҳаршәеит AAV-shRNA (short hairpin RNA) ҷыдала аҳәынаԥ PCx мРНК (AAV-shPCx) зықәыргыло, насгьы авирус мамзаргьы уи скрамблтә контроль (AAV-scr) Mfn2cKO аҳәынаԥқәа рыхшыбаҩ хәыҷы иҭаҳҵеит. Аинжекциа ҟаҵан аԥшьбатәи абжьараҿы (Асахьа 5А) PCx еффективтә нокдаун аиуразы PCx аекспресиа анеизҳаз аамҭазы (Асахьа 3С) насгьы PN ахәҭа ашьаҭа еиқәханы ианыҟаз аамҭазы (Асахьа 1А). Иазгәаҭатәуп, PCx ақәхра (Асахьа S8A) PN аԥсра ӷәӷәала арццакра ахь инагоит, уи инфекциа змаз ацәаҳәаҿы мацара ауп иахьыҟоу (Асахьа 5, В, С). PCx up-regulation иацу аметаболизмтә еффектқәа рмеханизм аилкааразы, ҳара PCx нокдаун ашьҭахь PNs рредокстә статус ҭаҳҵааит, насгьы AAV-медиированный оптический биосенсор Grx1-roGFP2 были одновременно выражены (Фигура S8, B до D) для оценки глутадочейнгиона8 релативного пептида). Анаҩс, ҳара ҩ-фотонтә флуоресценциатә ԥсҭазааратә сахьаҭыхратә микроскопии (FLIM) 7-бжьышәа зхыҵуа Mfn2cKO ахшыбаҩ ӷәӷәақәа рҿы мамзаргьы литерматқәа рконтроль мҩаԥаҳгеит, FLIM аҭагылазаашьақәа рыгәра агара ашьҭахь ацитоплазматә редокстә статус аҿы иҟалар зылшо аԥсахрақәа раарԥшразы (Асахьа S8, E инаркны G рҟынӡа). Анализ иаанарԥшит PCx аҳәара змам Mfn2cKO PNs заҵәык рыоксидациатә ҭагылазаашьаҿы еиҳаны аизҳара, уи аконтрольтә нейронқәа мамзаргьы Mfn2cKO PNs скрамбл шРНК мацара аазырԥшуа иреиԥшым (Асахьа 5, D и E). PCx аекспресиа ҵаҟа-регулиациа аныҟаз, ӷәӷәала аоксидтә ҭагылазаашьа аазырԥшуаз Mfn2cKO PNs рпроцент хынтә еиҳаны еизҳаит (Асахьа 5Е), уи иаанарԥшуеит PCx аиҵыхра еиҵахаз анеуронқәа рредокстә лшарақәа шрыхьчоз.
(А) Асхема, shPCx еиқәзыршәо ААВ аҭарҭәаразы аексперименталтә график аазырԥшуа, иарбоу аметаболизмтә мҩа аус анауа аамҭазы. (Б) 8-бжьышәа зхыҵуа ацеребеллартә ҟәшақәа рхаҭарнакратә конфокалтә фотосахьақәа Mfn2cKO аҳәынаԥқәа рҿы 4-бжьышәҭак рзы анти-кальциневинтә антитело рыла еиҭаргоуп. Амасштабтә ҵәҩан, 450мкм. (С) ААВ-трансдуцированные лупы в Пуркинье клеток плотности (односторонний анализ вариации; n = 3 до 4 мышей). Адыррақәа ргәыԥҵәага±SEM ҳәа иаарԥшуп; ***Р<0.001. (D) Ахаҭарнакратә FLIM асахьа иаанарԥшуеит 7-бжьышәа зхыҵуа PN абжьаратәи аԥсҭазаара аамҭа, аглутатионтә редокс-сенсор Grx1-roGFP2 аазырԥшуа аексперименттә ҭагылазаашьақәа рҿы. LUT (аԥшааратә таблица) аизыҟазаашьа: аиқәхара аамҭа абжьаӡара (пикосекундла). Амасштабтә ҵәҩан, 25мкм. (Е) Агистограмма иаанарԥшуеит Grx1-roGFP2 аԥсҭазааратә ҵакқәа рыларҵәара (D) (n=158 368 рҟынӡа ҩ-ҳәынаԥк рҿы ҭагылазаашьацыԥхьаӡа). Агистограмма зегьы рханы иҟоу апаи-график: иаанарԥшуеит еиҳа инаӡоу (аҟаԥшь, оксидтә) ма еиҳа икьаҿу (аҵәа, ирмаҷу) аԥсҭазаара ахә змоу ахәҭақәа рхыԥхьаӡара, урҭ CTRL-AAV-scr аҿы абжьаратәи аԥсҭазаара ахә 1 SD еиҳауп. (F) Иҟаҵоу амодел иаанарԥшуеит анеуронтә PCx аиқәыршәара ахьчаратә еффект.
Зегьы еизакны, абра иааҳго адыррақәа иаадырԥшуеит, MFN2 аиҭаҳәара инагӡаны еиқәнархар шалшо иԥхьагылоу PN ӷәӷәоу OXPHOS ацәыӡ, ӷәӷәала mtDNA аԥсыҽра, насгьы даараӡа анормалтәым ista-еиԥшу аморфологиа, убас ала еиԥмырҟьаӡакәа аҿиара аиуразы иԥхьагылоу ачымазарақәа рҿгьы. Анеуродегенерациа ахәыцрақәа рыԥсра аԥхьатәи аҭагылазаашьа азы еиҭаҵуа ашьақәырӷәӷәара анаҭоит. Аметаболизмтә еиҭакра абри аҩаӡара еиҳагьы иаҵшьны иаанарԥшуеит анеуронқәа атеросклероз рызцәырҵра рылшарала (ТСА ацикл аиҭашьақәыргылара), уи OXPHOS змам PNs рҿы PCx аҟазаара ааннакылоит, насгьы ахәҭақәа рыԥсра еизнарҳауеит, убас ала ахьчаратә роль нанагӡоит (Асахьа 5F).
Абри аҵараҿы ҳара ашьақәырӷәӷәарақәа ааҳгеит, PNs рҭак OXPHOS дисфункциа азы ԥыҭ-ԥыҭла TCA ацикл атеросклероз ахь аиасра шакәу, аметаболизмтә программақәа рыла еиҿкаау адифференциалтә активациатә мҩала. Ҳара еиуеиԥшым акомплементартә методқәа рыла апротеомтә анализ шьақәҳарӷәӷәеит, насгьы иааҳарԥшит амитохондриалтә дисфункциа ӷәӷәа анрықәшәо, анеуронқәа уаанӡа изеилымкаауаз аметаболизмтә еластичность шрымоу. Ҳара иџьаҳшьоит, зегьы rewiring апроцесс хымԥада иаанарԥшӡом атерминалтә метаболизмтә ҭагылазаашьа, анеуродегенерациа иацныҟәо ԥыҭ-ԥыҭла, насгьы ирхынҳәышьа змам, аха ҳара ҳдыррақәа иаҳдырбоит, уи аиқәырхаратә нейрон шьақәнаргылар шалшо, ахәыцрақәа рыԥсра аԥхьатәи аамҭазыгьы Афункционалтә компенсациа амеханизм. Абри аԥшаара иаанарԥшуеит анеуронқәа ацәеижь аҿы аметаболизмтә пластика ду шрымоу. Абри афакт ишьақәнарӷәӷәоит, анаҩс MFN2 еиҭа алагалара ихадоу аметаболизмтә маркерқәа рцәырҵра еиҭанакыр шалшо, насгьы PN адегенерациа аԥырҟәҟәаара шалшо. Уи аҭыԥан, уи атеросклероз ааннакылоит, насгьы анервқәа арццакуеит. транссексуал.
Ҳҭҵаарақәа рҿы зегь реиҳа узыршанхо аԥшаарақәа иреиуоуп OXPHOS змам PNs TCA ацикл аметаболизм рыԥсахра шрылшо, ҷыдала артериосклероз зырҿио анзимқәа рыла. Аметаболизмтә еиҭеиҿкаара аканцертә хәыцрақәа зегьы еицырзеиԥшу ҟазшьоуп, урҭ рҟынтә џьоукы аглутамин иақәгәыӷуеит ТСА ацикл абжьаратәи ахәҭақәа рыцҵаразы, аԥсыԥлагаратә еизыҟазаашьақәа зныҟәызго, насгьы алипидқәеи ануклеотидқәеи рбиосинтез аԥхьагылаҩцәа раартра еиқәзырхо (39 , 40). Аҵыхәтәантәи аҭҵаара иаанарԥшит, OXPHOS дисфункциа змоу аперифериатә тканьқәа рҿы, аглутамин/аглутамат аметаболизм аиҭеидҳәаларагьы еиҳа ихадоу ҟазшьоуп (5, 41), уаҟа аглутамин ТСА ацикл ахь аҭалара ахырхарҭа ахьыҟоу OXPHOS ааха ахьынӡаӷәӷәоу азы (41). ). Аха, ацәеижь аҿы анеуронтә метаболизмтә пластика аиԥшреи ачымазара аконтекст аҿы уи иамоу аҵакы азы еилыкка иҟоу ашьақәырӷәӷәарақәа ыҟам. Аҵыхәтәантәи in vitro ҭҵаара аҿы, раԥхьатәи акортикалтә нейронқәа анеуротрансмиссиазы аглутаматтә ӡҭачы еизыргоит, убас ала аметаболизмтә стресс аҭагылазаашьақәа рҿы оксидативтә метаболизми атеросклерози ацхраауеит (42). Иазгәаҭатәуп, ТСА ацикл анзим сукцинатдегидрогеназа афармакологиатә ингибициа аҵаҟа, пируват карбоксилациа акультуратә церебеллартә гранулатә нейронқәа рҿы оксалоацетат асинтез еиқәнархоит ҳәа агәра ганы иҟоуп (34). Аха ахшыбаҩ ахәҭақәа рҿы абарҭ амеханизмқәа рфизиологиатә ҵакы (атеросклероз еиҳарак астроцитқәа рҿы иҟоуп ҳәа иахьрыԥхьаӡо) уажәгьы акыр зҵазкуа афизиологиатә ҵакы амоуп (43). Абри аҭагылазаашьаҿы, ҳара ҳдыррақәа иаадырԥшуеит, ацәеижь аҿы OXPHOS ала иԥхасҭахаз PNs BCAA адеградациеи пируват карбоксилациеи рахь ииасыр шалшо, урҭ ҩ-хыҵхырҭа хадақәоуп TCA пул абжьаратәи ахәҭақәа рыцҵара. BCAA катаболизм анеуронтә енергиа аметаболизм аҿы иҟанаҵо ҳәа агәаанагара ҟаҵазаргьы, аглутамати ГАМКи анеуротрансмиссиазы рроль анаҩсгьы (44), уажәгьы абарҭ амеханизмқәа рзы шьақәырӷәӷәара ыҟам in vivo. Убри аҟнытә, имариоуп агәаанагара, дисфункционалтә ПН-қәа атеросклероз аизырҳарала ассимиляциатә процесс иацу ТСА абжьаратә ҟазшьақәа рхархәара автоматла рхарҭәаара рылшоит ҳәа. Хықәкыла, PCx аизырҳара аҭаххар ауеит аспартаттә ашьақар аҭахра аизырҳара азы, уи амитохондриалтә дисфункциа змоу ахәыцқәа рылаҵәараҿы иҳәоуп (45). Аха, ҳметаболомикатә анализ ҳәа акгьы аанамырԥшӡеит ҳәа акгьы ыҟам аиҭакрақәа рҭышәынтәалара аҩаӡараҿы аспартаттә ашьақар Mfn2cKO PNs (Асахьа S6A), уи, иҟалап, иаанарԥшуеит еиуеиԥшым аметаболизмтә ахархәара аспартаттә ашьақар апролиферациатә хәыцрақәеи амитоз ашьҭахьтәи анейронқәеи рыбжьара. PCx upregulation ииашоу амеханизм дисфункциональных нейронов in vivo иаанханы иҟоуп, ҳара иааҳарԥшит, ари заанаҵтәи аҭак акырӡа аҵакы шамоу нейронқәа рредокстә ҭагылазаашьа ахьчараҿы, уи аарԥшын FLIM аекспериментқәа рҿы ахшыбаҩ хәыҷы аҟәаҟәақәа рҿы. Хықәкыла, PNs PCx аизырҳара аԥырҟәҟәаара еиҳа аоксидтә ҭагылазаашьахь инагоит, насгьы ахәҭақәа рыԥсра арццакуеит. BCAA адеградациа активациеи пируват акарбоксилациеи амитохондриалтә дисфункциа аперифериатә тканьқәа рхарактеристика азы амҩақәа ракәӡам (7). Убри аҟнытә, урҭ OXPHOS-дефицит змоу анеуронқәа рзы раԥхьатәи аҭыԥ аанызкыло ҟазшьоуп, анеуродегенерациазы акыр зҵазкуа ҟазшьа заҵәык акәымзаргьы. .
Ахшыбаҩ хәыҷы ачымазара еиуеиԥшым анеуродегенеративтә чмазароуп, уи атаксиа ҳәа иааԥшуеит, лассы-лассы ПН-қәа ԥхасҭанатәуеит (46). Ари анеуронтә популациа ҷыдала амитохондриалтә дисфункциа азы еиҳа ицәгьауп, избан акәзар урҭ рыселективтә дегенерациа аҳәынаԥқәа рҿы ауаҩытәыҩсатә спиноцеребеллартә атаксиа аазырԥшуа амотортә симптомқәа рацәаны рыҿиаразы иазхоит (16, 47, 48). Аҳасабырбақәа рыла, амутанттә ген змоу трансгентә гәыҵхатә модель ауаҩытәыҩсатә спиноцеребеллартә атаксиа иадҳәалоуп, насгьы амитохондриалтә дисфункциа амоуп (49, 50), PNPH аҿы OXPHOS ацәмаҷра иахылҿиаауа аҭҵаара аҵакы ду шамоу азгәаҭаны. Убри аҟнытә, еиҳарак ианаалоит ари зеиԥшыҟам анеуронтә популациа ибзианы аиҟәыҭхара, насгьы аҭҵаара. Аха, ПН-қәа ақәыӷәӷәара даараӡа ишычҳауа, насгьы ахшыбаҩ хәыҷқәа зегьы рпопуляциа рыхәҭаа шмаҷу ҳхаҿы иааганы, омика шьаҭас измоу аҵарақәа жәпакы рзы, урҭ ахәҭақәа зегьы реиԥш еилыхны рыҟазаара уажәгьы уадаҩра дууп. Егьырҭ ахәҭа хкқәа (еиҳарак зықәра наӡахьоу рыхәҭақәа) рыла абсолютнтәи аконтаминациа ацәыӡра анагӡара залшом ҳәа ҳҳәар ҳалшоит, ҳара FACS еидаҳкылеит еффективтә диссоциациатә шьаҿак, ҵаҟатәи апротеомикатә анализ азы зыԥсы ҭоу нейронқәа рхыԥхьаӡара аиуразы, насгьы апротеинқәа рыхҩара ҳаракуп (3000 еиҿырԥшуа апротеинтә дыррақәа) (51). Ахәыцрақәа зегьы рыԥсҭазаара ахьчарала, абра иааҳго аметод алшара ҳнаҭоит амитохондриақәа рҿы аметаболизмтә мҩақәа рҿы иҟоу аԥсахрақәа рыгәаҭара мацара акәымкәа, уи ацитоплазматә ҩызцәа рҿы иҟоу аԥсахрақәа рыгәаҭара, уи амитохондриалтә мембрантә дыргақәа рхархәара анагӡара иацхраауеит, ахәыцрақәа рыхкқәа рбеиаразы. (52, 53). Ҳара иааҳарԥшуа аметод Пуркинье ихәыцрақәа рыҭҵаара мацара иадҳәалам, аха ачымазаҩцәа рыхшыбаҩ аҿы аметаболизмтә ԥсахрақәа рыӡбаразы, егьырҭ амитохондриалтә дисфункциа амодельқәагьы уахь иналаҵаны, иарбанзаалак ахәыцрақәа рҿы ахархәара амазар алшоит.
Аҵыхәтәаны, ҳара абри аметаболизм аиҭеиҿкаара апроцесс аҿы ахәшәтәратә ԥенџьыр ааҳарԥшит, уи ацеллулартә стресс ихадоу адыргақәа зынӡа ирхынҳәуеит, насгьы анеуронтә дегенерациа аԥырҟәҟәаара алшоит. Убри аҟнытә, абра зыӡбахә ҳәоу аиҭашьақәыргылара иамоу афункционалтә ҵакы аилкаара амитохондриалтә дисфункциа аан анеуронтә ԥсҭазаара ахьчаразы иҟоу ахәышәтәышьақәа рзы шьаҭанкылатәи аилкаарақәа ҳзаанагар алшоит. Ахшыбаҩ егьырҭ ахәыцрақәа рҿы аенергиа аметаболизм аҿы иҟоу аԥсахрақәа рыҭҵаара зызку ԥхьаҟатәи аҭҵаарақәа рыҭахуп, ари апринцип егьырҭ аневрологиатә чымазарақәа рҿы ахархәара шалыршахо инагӡаны аилкааразы.
MitoPark аҳәынаԥқәа ртәы уаанӡа иҳәан (31). C57BL/6N loxP фланкинг Mfn2 генқәа змоу аҳәынаԥқәа уаанӡа иҳәан (18) насгьы L7-Cre аҳәынаԥқәа рыла еиқәыршәан (23). Иҟалаз ҩбатәи агетерозиготтә хылҵшьҭрақәа агомозиготтә Mfn2loxP/Mfn2loxP аҳәынаԥқәа ирыладырҵәеит, Mfn2 азы Пуркинье-спецификтә гентә нокаутқәа раԥҵаразы (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Аиқәԥара ахәҭак аҿы, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP аллел (stop-mtYFP) еиҭа аиқәшәарақәа рыла иалагахеит (20). Аԥстәқәа рзы апроцедурақәа зегьы мҩаԥган европатәи, амилаҭтәи, аинституциатәи анапхгаратә ԥҟарақәа инарықәыршәаны, насгьы урҭ рықәшаҳаҭхеит Умвелттәи LandesamtfürNatur, насгьы Verbraucherschutz, North Reine-Westphalia, Germany. Аԥстәқәа русура иара убасгьы Европатәи аԥстәқәа рлабораториатә ҭҵаарақәа рфедерациа анапхгара иақәныҟәоит.
Зцәазтәым аԥҳәыс лымгәарҭа анаркотик анҭарҵалак ашьҭахь, аҳәынаԥ аембрион еиҟәыҭхоит (Е13). Акортекс 10 мМ Hepes ацҵаны Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) аҿы еиҟәганы, папаин (20 U/ml) еиԥш цистеин (1μg/ml) злоу Dulbecco's Modified Eagle's Medium ахь ииасит. Ацәеижь ДМЕМ аҿы инкубациа азутәуп) насгьы анзиматә еилаҵарала еиҟәыҭхатәуп. Мл) 37°C аҟны 20 минуҭк рыҩныҵҟа, насгьы 10% ажәтә шьаҭа ацҵаны ДМЕМ аҿы механикала ирҭәуеит. Ацеллюлозақәа полилизинла ихҩоу ашәырӡтә ҵәахырҭақәа рҿы еиҭарҳауан 6 см ҵаҟа иҟоу акультуратә ҭраҿы 2×106 мамзаргьы 0.5×105 ахәыцрақәа/см2 рыла асахьаҭыхратә анализ азы. сааҭ рышьҭахь, амедиум ԥсахын 1% B27 ацҵареи 0.5 мМ GlutaMax злоу Neurobasal serum-free амедиум ала. Анаҩс аԥышәара зегьы аан анеуронқәа 37°C 5% CO2 рҿы иаанкылан, насгьы чмазарак ахьтә знык ирҿарҵон. Арекомбинациа in vitro аиҿкааразы, 3мкл (24-well culture dish) мамзаргьы 0.5мкл (24-well plate) анаҩстәи AAV9 авирустә вектор ахархәара аиоуит аҩбатәи амш аҽны in vitro анеуронқәа рыхәышәтәра азы: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Адген, акаталог аномер 105530-ААВ9) и ААВ9.СМВ.ХИ.еГФП-Кре.ВПРЕ.СВ40 (Аддген, акаталог аномер 105545-ААВ9).
Агәыҵа Mfn1 и Mfn2 комплементартә ДНК (Addgene плазмида #23212 и #23213 рҟынтәи иаагоу) V5 еишьҭагылала (GKPIPNPLLGLDST) С-терминал аҿы иарбоуп, насгьы mCherry еидҵоуп афреим аҿы T2A еишьҭагылала. Grx1-roGFP2 ҳәа изышьҭоу Хаидельбергтәи Т.П. tdTomato акассета аԥсахрала, еиқәыршәоу аклонирование аметодқәа рыла, акассета pAAV-CAG-FLEX-tdTomato аҟәаҟәаҿы субклонтәын (Addgene референстә номер 28306) pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFGAV2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFNGAV-V5, ФЛЕКС-мЧерри-Т2А-МФН1-В5 и рААВ-САГ-ФЛЕКС-Гркс-роГФП2 векторы. Абас еиԥш иҟоу астратегиа ахархәан pAAV-CAG-FLEX-mCherry анапхгаратә вектор аԥҵаразы. ААВ-шПЦх аконструкциа аԥҵаразы, иаҭахуп аплазмидтә ААВ вектор (ВекторБилдер, пААВ [шРНК] -СМВ-мЧерри-У6-мПцх- [шРНК#1]), уи иаҵанакуеит ДНК ашьҭанеира, шРНК ахықәкы змоу аҳәынаԥ ПСХ (5′АГТАГЦТТГЦТАЦТААКТА 3′) U6 апромотора анапхгара аҵаҟа, mCherry ахархәара аиуеит CMV апромотора анапхгара аҵаҟа. Ацхыраагӡатә ААВ-векторқәа рҭыжьра мҩаԥган урҭ ҭзыжьыз иҟаиҵаз абжьгарақәа рыла (Cell Biolabs). Иааркьаҿны иуҳәозар, мЧерри-Т2А-МФН2-В5 (рААВ-САГ-ФЛЕКС-мЧерри-Т2А-МФН2-В5), мЧерри-Т2А-МФН1-В5 (рААВ-САГ-ФЛЕКС-мЧерри) мЧерри-Т2А-МФН1-В5 (рААВ-САГ-ФЛЕКС-мЧерри) мЧерри-МФЦВ2-59 атрансфекциа), (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) мамзаргьы Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) акод ҟазҵо аген, иара убасгьы AAV1 капсидтә протеин акод ҟазҵо, насгьы аксессуартә протеин Апакеттә плазмидтә плазмида, акальциумтә фосфат аметод ахархәарала. Авирус амцхә асупернатант аиура мҩаԥысит аҵааршәра-аӡыҭратә циклқәа рыла аҵаа ҩа/аетанолтә ваннаҿы, насгьы афосфаттә буфертә ҵаатәыҩсатә ӡы (ПБС) аҿы еилыхыз ахәыцқәа рыла. ААВ авектор еиԥҟьам иодиксанолтә градиенттә ультрацентрифугациала (24 сааҭ 32,000 rpm 4°C) ирыцқьан, насгьы Amicon ultra-15 центрифугалтә фильтр ахархәарала еиқәыршәан. ААВ1-САГ-ФЛЕКС-мЧерри-Т2А-МФН2-В5 [2,9×1013 геномтә копиеи (ГС)/мл], ААВ1-САГ-ФЛЕКС-мЧерри (6,1×1012 ГС/мл), ААВ1-САГ-ФЛЕКС реалтәи аамҭала еилкаан, ԥасатәи аамҭала еилкаан). (qPCR) -МФН1-В5 (1,9×1013 ГС/мл) и ААВ1-САГ-ФЛЕКС-Гркс-роГФП2 (8,9×1012 ГС/мл).
Аԥхьатәи анейронқәа ҵаа-хьҭа 1x PBS рҿы ирыцқьан, пеллетла, нас 0.5% Triton X-100 / 0.5% содиум деоксихолат/PBS лизистә буфер аҿы еиԥшны еиқәыршәан, фосфатазаи протеаза ингибитори (Roche) злоу. Апротеинқәа рыԥхьаӡара мҩаԥган бицинхонинтәи ацид анализ ахархәарала (Thermo Fisher Scientific). Анаҩс апротеинқәа SDS-полиакриламидтә гелтә электрофорез ала еиҟәыҭханы, поливинилиденфлуоридтә мембранаҿы (GE Healthcare) иқәырҵеит. Иҷыдоу аҭыԥқәа аанкыланы, раԥхьатәи аантитело (еиҳа инарҭбааны иахәаԥш аҭаӡҩыра S1) 5% аӡы аҿы ТБСТ (Трис-буфертә ҵаа Твин ацны), аӡәӡәаратә шьаҿақәеи аҩбатәи антителои ТБСТ Инкубат аҿы инкубациа рзутәуп. Аԥхьатәи антитело ацҵаны ҵхыбжьон +4°C аҟны инкубациа азутәуп. Аӡәӡәара ашьҭахь, аҩбатәи антитело 2 сааҭ ауада аҳауа атемператураҿы ақәыргылатәуп. Анаҩс, абри аҩыза аблот анти-β-актинтә антитело ацҵаны, абри аҩыза аҭагалара шьақәырӷәӷәан. Ахемилуминесценциа аиагареи ахемилуминесценциа арӷәӷәареи рыла аԥшаара (GE Healthcare).
Уаанӡа ашәырӡтә ҵәахырҭақәа рҿы еиҭаҳаз анеуронқәа 4% параформальдегид (ПФА)/ПБС рыла иарбоу аамҭазы ауада аҳауа атемператураҿы 10 минуҭк рыҩныҵҟа идырӷәӷәеит. Ахҩақәа раԥхьаӡа иргыланы 0,1% Triton X-100/PBS 5 минуҭк рыҩныҵҟа ауада аҳауа атемператураҿы ирҭәуеит, насгьы аблокиртә буфер аҿы [3% ажәтә шьаҭа альбумин (BSA)/PBS]. Аҩбатәи амш аҽны, ахҩақәа аблокиртә буфер ала ирыӡәӡәеит, насгьы иахәҭоу флуорофор-кониугаттә ҩбатәи антитело 2 сааҭ рыҩныҵҟа ауада аҳауа атемператураҿы инкубациа рзуит; ҵыхәтәан, асамбльқәа 4′,6-диамидино-2 -Фенилиндол (DAPI) рыла PBS-ла ибзианы ирыӡәӡәеит, насгьы Aqua-Poly/Mount ала амикроскоптә слаид аҿы идырӷәӷәеит.
Аҳәынаԥқәа (ахацәеи аҳәсеи) анестезиа рзыҟаҵан интраперитонеалтә инжекциала кетамин (130 мг/кг) и ксилазин (10 мг/кг) насгьы ацәаҵаҟны карпрофен аналгетик (5 мг/кг) , Иара убас стереотактикатә инструмент (Kopd a pamf) еиқәыршәаны иҭарҵеит. Ахыбаҩ аартны, ахаԥыцтә дриль ахархәарала, ахшыбаҩ хәыҷы абаҩ иақәшәо ​​ахәҭа ԥсыҽтәуп (ламбда аҟынтә: аҵыхәа 1,8, аганахьтәи 1, IV, V лобулақәа ирықәшәо). Ахыбаҩ аҿы акылҵәара хәыҷы ҟашәҵарц азы, ҵаҟа иҟоу ашьацҳәақәа ԥырхагамхарц азы, ахыбаҩ аҿы акылҵәара хәыҷы ҟашәҵа. Нас ҵаӷаӡа иҭыху аҵәцатә капилляр ҵаҟа-ҵаҟа иҭарҵоит микро-ҭыԥ (-1.3 инаркны -1 рҟынӡа адура матер агәаҵәа аганахьала), насгьы 200 инаркны 300 нл ААВ микроинжектор (Наришиге) иҭарҵоит напылатәи ашприцқәа рыла (Наришиге) аамҭа 20 рҟынӡа. минуҭк аԥенџьыр. Аинфузиа ашьҭахь, акапиллари даҽа 10 минуҭк рыла иҭажәгал, авирус инагӡаны алаҵәара алыршаразы. Акапиллариақәа анҭырхлак ашьҭахь, ацәа гәцаракрала иӡахуеит, ахәра аҵәыҵәра маҷхарц, насгьы аԥстәы ахәышәтәра алнаршарц азы. Аԥстәқәа аоперациа ашьҭахь мышқәак рыҩныҵҟа аналгетикқәа (каспофен) рыла ирхәышәтәуан, уи аамҭазы рцәеижьтә ҭагылазаашьа гәцаракрала ихылаԥшуан, анаҩс иарбоу аамҭазы еутаназиа рзыруит. Апроцедурақәа зегьы мҩаԥган европатәи, амилаҭтәи, аинституционалтәи анапхгаратә ԥҟарақәа инарықәыршәаны, насгьы урҭ ақәшаҳаҭхеит Умвелт иҟоу LandesamtfürNatur, насгьы Verbraucherschutz, North Reine-Westphalia, Germany.
Аԥстәқәа анаркоз рзыҟаҵан кетамин (100 мг/кг) ксилазин (10 мг/кг) рыла, насгьы агәы раԥхьа 0,1 М ПБС рыла ирҭәит, нас 4% ПФА ПБС аҿы. Ацәеижь еиҟәырҟьаны 4% PFA/PBS 4°C аҟны ҵхыбжьон идырӷәӷәеит. Авибрациатә ӷәы (Leica Microsystems GmbH, Вена, Австриа) ахархәара аиоуит PBS аҿы иҟоу ахшыбаҩ аҟынтәи асагиталтә ҟәша (50 мкм ажәпара) аиқәыршәаразы. Даҽакала иарбамзар, хыхь ишҳәаз еиԥш (13) ихақәиҭны иӡсо аҟәшақәа рышәра мҩаԥган ауада атемператураҿы, насгьы еилаарцыруа. Ажәакала, актәи, иҳауз аԥыҵәҵәақәа 0,5% Triton X-100/PBS рыла 15 минуҭк рыҩныҵҟа ауада аҳауа атемператураҿы ирылаҵан; епитопқәак рзы (Pcx и Shmt2), 80°C (PH 9) аҟны трис-ЕДТА буфер аҿы абри ашьаҿа аҭыԥан 25 минуҭк рыҩныҵҟа аԥыҵәҵәақәа рырԥхара. Анаҩс, аҟәша раԥхьатәи антитело (иахәаԥш аҭаӡҩыра S1) аблокиртә буфер аҿы (3% BSA/PBS) 4°C аҟны ҵхыбжьон еилаарцыруа иҭарҵон. Адырҩаҽны, аҟәша аблокиртә буфер ала ирыӡәӡәеит, насгьы иахәҭоу флуорофор-кониугаттә ҩбатәи антитело 2 сааҭ ауада аҳауа атемператураҿы инкубациа рзуит; ҵыхәтәаны, аҟәша ибзианы PBS-ла ирыӡәӡәеит, DAPI-ла еиқәыршәан, нас AquaPolymount On a microscope slide ала идырӷәӷәеит.
Аҿырԥштәы асахьа ҭыхразы ахархәара аиуит алазертә сканертә конфокалтә микроскоп (TCS SP8-X мамзаргьы TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) лашаратә лазер шкәакәала, 405 диодтә ультрафиолеттә лазерла еиқәыршәаны. Афлуорофор агәыҭҟьареи агибридтә детектор (HyDs) ала асигнал аизгареи рыла, LAS-X апрограмматә еиқәыршәара ахархәан Никвист асамлинг инақәыршәаны еиқәыргылоу асахьақәа реизгаразы еишьҭагылоу режимла: ахаҭәааратәым апанельқәа рзы, уи динамикатә сигналқәоуп (иаҳҳәап, асоматикатә хәыцқәеи адендритқәеи рҿы) mt БраитР режим). 0.3 инаркны 6 нс рҟынӡа ашәқәа рыҭара ахархәара аиуеит аҵыхәтәантәи аҭагылазаашьа армаҷразы.
Аамҭаҵәҟьаҿы еилыԥшаау ахәҭақәа рсахьаҭыхра. 1% В27 ацҵареи 0,5 мМ ГлутаМакси злоу Неуробазаль-А амедиум аҿы аилыԥшаара ашьҭахь, ахәыцқәа иаразнак поли-л-лизинла ишәу ашәырӡтә слаидқәа рҿы еиҭаҳан (μ-Slide8 Well, Ibidi, каталог номер 80826) , насгьы ахәыцқәа рзы 1% CO2 анхара. Аамҭа иақәшәо ​​асахьаҭыхра мҩаԥган Leica SP8 алазертә сканертә конфокалтә микроскоп ала, уи алазер шкәакәа, HyD, 63×[1.4 numerical aperture (NA)] азеиҭынтә объективтә линза, насгьы арԥхаратә етап ала еиқәыршәан.
Аҳәынаԥ ирласны акарбон диоксид ала анаркоз азыруит, ахшыбаҩ ирласны ахыбаҩ аҟынтәи иааганы, 200 мкм ҟәазрала иԥҟан (13С амаркировка аексперимент азы) мамзаргьы 275 мкм ҟәазрала (ҩ-фотонк рԥышәарақәа рзы) асагиталтә ҟәша анаҩстәи аматериалқәа рыла иҭәын (The VHr5 Scientific, Walldorf, Germany) ҭәуп абри аҩыза ахәҭақәа рыла: 125 мМ ҵааҵас ихьҭоу, акарбон зҭәу (95% O2 и 5% CO2) еиҵоу Ca2 + анапылаҟаҵаратә цереброспинальтә ӡы (ACSF) NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ буфер м3O, Na3O. агликоза, 0,5 мМ CaCl2 и 3,5 мМ MgCl2 (осмотикатә қәыӷәӷәара 310-330 ммоль рҟынӡа). Иҳауз ахшыбаҩ аҟәаҟәақәа еиҳа иҳараку Ca2 + ACSF злоу аинкубациа аԥхьатәи акамерахь ииагатәуп (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натриумтә фосфаттә буфер, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-glucose, Ca2.0 мМ, Ca2.0l MgCl2) Абжьаратә) pH 7.4 и 310 до 320 ммоль).
Асахьаҭыхратә процесс аан, аԥыҵәҵәақәа ҷыдалатәи асахьаҭыхратә ауадахь ииагахеит, насгьы аԥышәа мҩаԥган еиԥмырҟьаӡакәа ACSF перфузиа аҵаҟа, 32° инаркны 33°C рҟынӡа атемпература еиԥшымкәа. Асахьаҭыхразы ахархәара аиуит амультифотонтә лазертә сканертә микроскоп (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), Leica 25x объективтә линза (NA 0.95, аӡы), Ti: Sapphire алазер (Chameleon Vision II, Coherent) рыла еиқәыршәаз. FLIM амодуль (ПикоХарп300, ПикоКвант).
Грх1-роГФП2 аҟнытә ФЛИМ. ПН-қәа рцитоплазматә редокстә ҭагылазаашьа аԥсахрақәа ҩ-фотонк змоу FLIM ала ахшыбаҩ асагиталтә ҟәаҟәақәа рҿы ршәара мҩаԥысит, уаҟа Grx1-roGFP2 биосенсор ПН-қәа ирызкын. PN ашьаҭаҿы, аиуратә ҭыԥ алхуп 50-80 мкм ҟынӡа аҟәаҟәа аҿықәан, ԥсҭазааратә PN ыҟазарц азы (даҽакала иуҳәозар, дендритқәа ирыкәшо ацәаҳәақәа рструктура мамзаргьы анеуронтә морфологиатә ԥсахрақәа рыҟамзаара) насгьы ҩынтәны позитивтә roGFP2 ацәаныррақәеи ААВх-нцеекс акодировкеи ш. мЧерри). 2х диджиталтә зумла еизгатәуп еизакны иҟоу асахьа [агәыҭҟьаратә цәқәырԥа аҵарра: 890 нм; 512 нм 512 пиксель]. Аԥшаара: аҩныҵҟатәи HyD, флуоресцеин изотиоцианат (FITC) афильтртә гәыԥ] насгьы 2-3 минуҭ рыҩныҵҟа асахьа абжьаратәи аҟаҵара рхы иадырхәоит, ахәы ақәыргыларазы иазырхоу афотонқәа реизгара азы (зегьы еизакны 1000 фотон). Ачувствительность Grx1-roGFP2 проба и проверка условий FLIM проводились мониторингом жизненного значения roGFP2 при добавлении екзогенного 10 мМ H2O2 в перфузии ACSF (максимальное оксидацию, в результате чего увеличивается жизненный диминитхол). аиҵахара, уи иахҟьаны аԥсҭазаара аиҵахара ҟалоит) (Асахьа S8, D инаркны G рҟынӡа). Иҳауз аҭакқәа ранализ азы FLIMfit 5.1.1 апрограмматә еиқәыршәара ахархәара, асахьа зегьы аекспоненциалтә ԥхасҭара ахәы ашәагаа IRF (инструмент аҭак аҟаҵаратә функциа) иақәыршәатәуп, насгьы χ2 иааигәаны 1 ауп. ахаҭәааразы ахархәара аиуеит.
Амитохондриалтә потенциал анализ. Аҵартә ҟәша 100 нМ ТМРМ 30 минуҭк рыла ишиашоу перфузиа зызуыз АЦСФ иацҵаны ианҭарҵа ашьҭахь, ПНқәа рмитохондриалтә потенциал аԥсахрақәа ҩ-фотонк змоу амикроскоп ала ршәеит. TMRM асахьаҭыхра мҩаԥган 920 нм аҟны азонд агәыҭҟьарала, насгьы аҩныҵҟатәи HyD (тетраметилродамин изотиоцианат: 585/40 нм) ахархәарала асигналқәа реизгаразы; еиԥшу агәыҭҟьаратә цәқәырԥа аҵарра ахархәарала, аха еиуеиԥшым аҩныҵҟатәи HyD (FITC :525/50) ахархәарала mtYFP асахьа ҭыхразы. ImageJ's Image Calculator аплагин ахархәара, амитохондриалтә потенциал ахәшьара азы, кәаԥк аҩаӡараҿы. Иааркьаҿны иуҳәозар, аплагинтә еиҟаратә: сигнал = мин (mtYFP, TMRM) ахархәара аиуеит амитохондриалтә регион аилыкааразы, уи иаанарԥшуеит TMRM сигнал Пуркинџье Сомали аҿы иақәшәо ​​ацәаҳәа аконфокалтә сахьаҿы. Анаҩс иалҵуа амаскаҿы апиксельтә ҭыԥ еилкаахоит, насгьы mtYFP канал иақәшәо ​​аҳәаа зныктәи асахьаҿы анормализациа азухоит, амитохондриалтә потенциал аазырԥшуа амитохондриалтә фракциа аиуразы.
Асахьа еиқәыршәан Huygens Pro (Саиентификтәи абжьы асахьаҭыхра) апрограмматә еиқәыршәара ала. Акаҵкәырқәа рысканер асахьа азы, каҵкәырк амонтаж ҟаҵоуп LAS-X апрограмматә еиқәыршәара ала иҟоу автоматтә ҭаӡахратә алгоритм ахархәарала. Асахьа акалибровка ашьҭахь, ImageJ еиԥш Adobe Photoshop ахархәарала асахьа анаҩстәи аус адулареи ашәахәеи аконтрасти еиԥшны еиқәыршәатәуп. Аграфика азыҟаҵаразы Adobe Illustrator ахархәара.
мтДНК афокус анализ. мтДНК-тә ԥхасҭақәа рхыԥхьаӡара конфокалтә микроскоп ала ДНК-аҿагыларатә антицелақәа рыла иарбоу ахшыбаҩ хәыҷы аҟәшақәа рҿы еилкаан. Иарбанзаалак ахықәкытә ҭыԥ еиқәыршәан ахәҭа ацәеижьи ахәыцра ануклеуси рзы, насгьы уи иаҵанакуа аҭыԥ ԥхьаӡан Multi Measure аплагин (ImageJ software) ахархәарала. Ацитоплазматә ҭыԥ аиуразы ахәыцра ацәеижь аҭыԥ аҟынтәи ануклеартә ҭыԥ аныхтәуп. Аҵыхәтәаны, Analyze Particles аплагин (ImageJ software) ахархәан автоматла мтДНК аазырԥшуа ацитоплазматә ДНК аҭыԥқәа рыԥхьаӡаразы, насгьы иҟаҵаз аҭакқәа CTRL аҳәынаԥқәа р-PN абжьаратәи аҩаӡара ахь инормализациан. Аҵыхәтәақәа ануклеозидқәа рыбжьаратәи ахыԥхьаӡара еиԥш иаарԥшуп.
Апротеин аекспресиа анализ. ImageJ's Image Calculator аплагин ахархәара PN аҟны апротеин аҟазаара ахәшьара азы, кәаԥк аҩаӡараҿы. Иааркьаҿны иуҳәозар, иақәшәо ​​ацәаҳәа аконфокалтә ҭыхымҭаҿы, еиҟаратә: сигнал = мин (mtYFP, антитело) ала, Пуркина иҟоу антителок ахь иммунореактивность аазырԥшуа амитохондриалтә регион еилкаауп. Анаҩс иалҵуа амаскаҿы апиксельтә ҭыԥ еилкаахоит, насгьы mtYFP канал иақәшәо ​​аԥынгылатә стака заҵәыктәи асахьаҿы анормализациа рзухоит, иаарԥшу апротеин амитохондриалтә фракциа аиуразы.
Пуркинье ихәыцрақәа рыҵарра анализ. ImageJ аҟны иҟоу Cell Counter аплагин ахархәан Пуркинье иҭбаара ахәшьара аҭаразы, иԥхьаӡаз Пуркинье ихәыцрақәа рыԥхьаӡа иԥхьаӡоу ахәыцрақәа иааныркыло ахшыбаҩ хәыҷы ацәаҳәа аурала еиҩшаны.
Аҿырԥштәқәа реиқәыршәареи реизгареи. Аконтрольтә гәыԥ аҟынтәи ахшыбаҩқәеи Mfn2cKO аҳәынаԥқәеи 2% PFA/2.5% глутаральдегид 0.1 М фосфаттә буфер (ПБ) аҿы идырӷәӷәеит, насгьы акороналтә ҟәша рхиан ацилиатқәа рыла (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австриа) (Ажәпара 50 инаркны ThePBn buffer μm1 рҟынӡа) тетраоксиди 1,5% калиум ферроцианиди ауада аҳауа атемператураҿы сааҭк рыҩныҵҟа. Аҟәша хынтә ӡыла ирыӡәӡәеит, нас 70% етанолла 1% уранилацетат злоу 20 минуҭк рыҩныҵҟа иҟәашьын. Анаҩс аҟәша ӡы рцәыӡит еихшоу алкоголь аҿы, насгьы Дуркупан АСМ (Аралдиттә ҭарҭәаратә ҵла М) епоксидтә ҵла (Електронтә микроскоптә ҭҵаарақәа, акаталог аномер 14040) аҿы силиконла ишәу ашәырӡтә слаидқәа рыбжьара иҭарҵеит, насгьы аҵыхәтәан 60°C аҟны аԥшьы аҿы формиризациа рзуит48 hours. Ахшыбаҩ хәыҷы аҭыԥ алхны, 50 нм ультратонктәи аҟәша Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австриа) аҿы иԥҟан, насгьы 2×1 мм ҵаҟа полистиролтә плёнкала ихҩоу аџьаз ҵәҩанҵәы аҿы иалххеит. Аҟәша 4% уранилацетат H2O аҿы 10 минуҭ рыла иҟәашьын, H2O ала акырынтә ирыӡәӡәеит, нас Реинольдс ицитрат H2O ала 10 минуҭк рыла, нас H2O ала акырынтә ирыӡәӡәеит. Амикрографқәа ҭырхуан еиҭагаратә електронтә микроскоп Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ала, TVIPS (Тиец авидео-сахьақәа рызнеиратә система) TemCam-F416 адиджиталтә камера (TVIPS GmbH, Gauting, USA) ахархәарала. Германиа).
ААВ змоу аҳәынаԥқәа рзы ахшыбаҩ еиҟәыҭханы 1 мм ҟәазра змоу асагиталтә ҟәша ҟаҵаны иԥҟан, насгьы ахшыбаҩ хәыҷы флуоресценциатә микроскоп ала иҭҵаахон, ААВ змоу ацәаҳәа аилкааразы (даҽакала иуҳәозар, mCherry аазырԥшуа). ААВ аинжекциа Пуркинье ихәыцратә шьаҭа (иаҳҳәап, ашьаҭа зегьы ҳәа ҳҳәар ҳалшоит) ҩ-хшыбаҩ хәыҷык еишьҭагылоу ҩ-цәаҳәак рҿы даараӡа иҳараку атрансдукциатә еффективра ахьаанарԥшуа аекспериментқәа мацара рхы иадырхәоит. ААВ-трансдукциа зызуыз ацәаҳәа ҵхык ашьҭахьтәи афиксациазы микродиссекциа азуын (4% ПФА и 2,5% глутаральдегид 0,1 М какао буфер аҿы) насгьы анаҩс аус адулара мҩаԥган. EPON аҭарҭәаразы, иҭышәынтәалоу ахәҭа 0.1 М натриумтәи какао буферла (Applichem) иӡәӡәан, насгьы 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) 0.1 М натриумтәи какао буферла (Applichem) 4 Сааҭ иҭарҵон, нас 2 сааҭ ирыӡәӡәан. 0.1 М кокамидтә буфер ала 3 раан иҟашәҵа. Анаҩс, аетанол ахаларатә еишьҭагыла ахархәан аетанол зегьы 4°C аҟны 15 минуҭк рыҩныҵҟа аинкубациа азы, ахәҭа аӡы ацәыӡразы. Ацәеижь пропилен оксид ахь ииаганы, 4°C атемператураҿы EPON (Sigma-Aldrich) аҿы ҵхыбжьон инкубациа рзуит. Ацәеижь ҿыц ЕПОН аҿы 2 сааҭ ауада аҳауа атемператураҿы иҭажәгал, нас 62°C ахь 72 сааҭ ҭажәгал. Ультрамикротом (Leica Microsystems, UC6) ахархәарала, насгьы алмазтә ӷәы (Diatome, Biel, Switzerland) 70 нм ультраҵаӷа аҟәша ԥҟаны, 1.5% уранилацетатла 37°C аҟны 15 минуҭк рыла ашәыга, насгьы 4 минуҭ ацәаҟәа цитраттә ӡыҭрала ашәыга. Аелектронтә микрографқәа ҭыхуп JEM-2100 Plus еиҭагаратә електронтә микроскоп (JEOL) ахархәарала, уи Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) ҳәа изышьҭоу апрограмматә еиқәыршәара DigitalMicrograph (Gatan) ала еиқәыршәоуп. Анализ азы електронтә микрографқәа 5000× мамзаргьы 10,000× диджиталтә зумла ирыдыркылеит.
Амитохондриақәа рморфологиатә анализ. Анализқәа зегьы рзы, хаҭалатәи амитохондриақәа рконтурқәа ImageJ апрограмматә еиқәыршәара ахархәарала диджиталтә сахьақәа рҿы напыла иаарԥшын. Еиуеиԥшым аморфологиатә параметрқәа анализ рзухоит. Амитохондриалтә ҵаӷара аарԥшуп процентла, зегьы еицырзеиԥшу амитохондриалтә ҭыԥ ацитоплазма аҭыԥ ала ашарала (ацитоплазма аҭыԥ = ахәыцра аҭыԥ-ахәыцра ануклеус аҭыԥ) × 100. Амитохондриақәа рыгьежьра ҳәаақәҵоуп аформулала [4π∙2(аҭыԥ)/периметр]. Амитохондриақәа рыиста морфологиа анализ азуны, ҩ-категориак рыла еихшан («тубулартәи» насгьы «блистертәи») рформа хадақәа рыла.
Аутофагосома/лизосома рыԥхьаӡеи рыҵарра анализи. ImageJ апрограмматә еиқәыршәара ахархәарала, адиджиталтә сахьаҿы аутофагосомақәа/лизосомақәа зегьы рконтурқәа напыла рышьақәыргыларазы. Аутофагосома/лизосома аҭыԥ аарԥшуп процентла, зегьы еизакны аутофагосома/лизосома аилазаашьа аҭыԥ ацитоплазма аҭыԥ ала еиҩшаны (ацитоплазма аҭыԥ=ахәыц аҭыԥ-ануклеус аҭыԥ)×100. Аутофагосомақәа/лизосомақәа рыҭбаара рыԥхьаӡоит зегьы еизакны аутофагосомақәа/лизосомақәа рыструктурақәа рыла еиҩшаны (цитоплазматә ҭыԥла) (цитоплазматә ҭыԥ = хәыцратә ҭыԥ-ануклеартә ҭыԥ).
Аҵартә еихшареи аҿырԥштәы аиқәыршәареи рзы адыргақәа рышьақәыргылара. Агликоза анырҵара зҭаху аԥышәарақәа рзы, ахшыбаҩ ӷәӷәа аҟәаҟәақәа аинкубациа аԥхьатәи акамерахь ииагатәуп, уа иҟоуп акарбон ҭәу (95% O2 и 5% CO2), иҳараку Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натриум м2O, 1.25 мМ натриум фосфат50). 25,0 мМ д-гликоза, 1,0 мМ CaCl 2 и 2,0 мМ MgCl 2, рН 7,4 и 310 320 мОсм ахь ирхиоу), уа агликоза 13 С 6- Агликоза аԥсахра (Еурисотоп, каталогтә номер CLM9-1). Пируваттә маркировка зҭаху аԥышәарақәа рзы, ахшыбаҩ аҟәаҟәақәа еиҳа иҳараку Ca2 + ACSF ахь ииагатәуп (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натриумтә фосфаттә буфер, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d.2C m0d, Ca0M MgCl2, pH 7.4 ахь еиқәыршәаны, 310 ахь 320mOsm ахь еиқәыршәаны), 1мМ 1-[1-13C]пируват (Еурисотоп, акаталогтә номер CLM-1082) ацҵаны. Аҟәша 90 минуҭк 37°C аҟны иҭаҵатәуп. Аԥышәара анҵәамҭазы, аҟәша ирласны ирыӡәӡәеит 75 мМ аммониум карбонат злоу аӡтә ӡҭаҵала (рН 7,4), нас 40:40:20 (v:v:v) ацетонитрил (ACN): аметанол: аӡы аҿы еиԥшны еиқәыршәан. Аҟәша 30 минуҭк аҵааҿы ианҭаҵаха ашьҭахь, аҿырԥштәқәа 21,000 г 10 минуҭк 4°C аҟны ацентрифуга рҭарҵеит, насгьы ицқьоу асупернатант SpeedVac аконцентратор аҿы идырҩеит. Иалҵыз ирҩаз аметаболиттә пеллет анализ ҟаҵахаанӡа -80°C аҟны иҵәахын.
С-хҵара змоу аминоацидқәа 13 рӡытә хроматографиа-массатә спектрометриатә анализ. Аӡытә хроматографиа-массатә спектрометриа (LC-MS) анализ азы, аметаболиттә пеллет 75мкл LC-MS градустә ӡы (Honeywell) аҿы еиҭаҵан. 21,000 г 5 минуҭк 4°C аҟны ацентрифуга ашьҭахь, 20 мкл ирыцқьоу асупернатант аминоацидтә флукс анализ азы ахархәара аиоуит, егьырҭ аекстрактқәа иаразнак анионтә анализ азы ахархәара аиоуит (ҵаҟа иаҳәа). Аминоацидтә анализ мҩаԥган ԥыҭрак ашьҭахь иҳәаз абензоилхлорид дериватизациа апротокол ахархәарала (55, 56). Актәи ашьаҿаҿы 10мкл 100 мМ натриум карбонат (Сигма-Олдрих) 20мкл метаболиттә екстракт иацҵан, нас 10мкл 2% бензоилхлорид (Сигма-Олдрих) LC градус ACN иацҵан. Аҿырԥштәы кьаҿк ала еикәарҳәын, нас 21,000 г 5 минуҭк 20°C аҟны ацентрифуга рзыҟаҵан. Ирыцқьоу асупернатант 2 мл зку автосамплертә флакон ахь ииагатәуп, аконустә ҵәца ҭарҭәаны (200 мл аҭбаара). Аҿырԥштәқәа анализ рзуын Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) ҳәа изышьҭоу амассатә спектрометр (Thermo Fisher Scientific) иацҵоу Acquity iClass ультра-иҳараку аусуратә LC система (Waters) ахархәарала. Анализ азы 2мкл дериватизациа зызу аҿырԥштәы 100×1.0 мм ӷәӷәара змоу силикат Т3 колонка (Waters) 1.8мкм ҟазшьа змоу ахәҭакқәа зҭоу иҭарҵеит. Аӡы ацара амҽхак 100мкл/мин, насгьы абуфертә система шьақәгылоуп абуфер А (10 мМ аммониум формат, 0,15% форминтә ашьақар аӡаҿы) насгьы абуфер В (АСН). Аградиент абри аҩызауп: 0%B 0 минуҭ рзы; 0%Б. 0 инаркны 15% рҟынӡа В 0 инаркны 0,1 минуҭ рҟынӡа; 15 - 17% В 0,1 - 0,5 минуҭ рзы; В 17-55% 0,5-14 минуҭ рзы; В 55-70% 14-14,5 минуҭ рзы; 14,5 ҟынӡа 70 ҟынӡа 100% В 18 минуҭ рзы; 100% В 18-19 минуҭ рзы; 100 0% В 19 19,1 минуҭ рзы; 0% В 19,1 инаркны 28 минуҭ рҟынӡа (55, 56). QE-HF массатә спектрометр аус ауеит позитивтә ионизациатә режим аҿы массатә диапазон м/з (масса/заряд аизыҟазаашьа) 50 инаркны 750 рҟынӡа. Ирԥхоу аелектроспреи аионизациа (ЕСИ) ахыҵхырҭа аус ауеит 3,5 кВ аԥсыӡтә амчхарала, 250°С акапилляртә температураҿы, 60 АУ (арбитрартә еизакқәа), ацхыраагӡатә аҳауа ацәырҵраҿы 20 АУ. 250°С. S аблақәа 60 AU еиқәыршәоуп.
Анионтә хроматографиа-МС анализ 13С ҳәа изышьҭоу аорганикатә ашьақарқәа. Иаанхаз аметаболиттә ԥсыӡ (55мкл) анализ азуын Dionex ионтә хроматографиатә система (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ахархәарала, уи QE-HF масс-спектрометр (Thermo Fisher Scientific) иацҵаны. Ажәакала, 5мкл аметаболиттә еихшьаала HPLC (2 мм×250 мм, ахәҭаҷқәа ршәагаа 4мкм, Thermo Fisher Scientific) ала еиқәыршәаз Дионекс ИонПак AS11-НС аколонна иҭарҵеит, 1 (ммHC2 ммHC2 ахьчаҩ) аҭәратә режим аҿы. 4мкм, Термо Фишер Саиентифик). Аколонна атемпература 30°C еиқәырханы иҟоуп, автосамплер 6°C ахь еиқәыршәоуп. Аӡы ацҵаны иҟоу аполиум гидроксидтә картридж ахархәара, елиуенттә генератор ала аполиум гидроксидтә градиент аԥҵаразы. Аметаболитқәа реиҟәыҭхара 380 мкл/мин ацара амҽхак ала, абри аҩыза аградиент ахархәарала: 0 инаркны 3 минуҭ рҟынӡа, 10 мМ КОН; 3-12 минуҭ, 10-50 мМ КОН; 12-19 минуҭ, 50-100 мМ КОН; 19 инаркны 21 минуҭ рҟынӡа , 100 мМ КОН; 21 - 21,5 минуҭ, 100 - 10 мМ КОН. Аколонна 10 мМ KOH ҵаҟа 8,5 минуҭк еиҭа еиқәыршәан.
Елуированные метаболиты объединяются с 150мкл/мин изопропанол дополнением потока после колонки, а затем направляются к высокоразрешающему масс-спектрометру, работающему в режиме негативной ионизации. MS м/з 50 инаркны 750 рҟынӡа 60,000 ррезолюциала амассатә диапазон ахылаԥшра мҩаԥнагоит. AGC 1×106 еиқәыршәоуп, насгьы иреиҳау аионтә аамҭа 100 мс аҟны иаанхоит. Ирԥхоу ЕСИ ахыҵхырҭа аус ауан 3,5 кВ ақәҭәаратә напҟьарала. Аионтә хыҵхырҭа егьырҭ аҭагылазаашьақәа ртәы абри аҩызауп: акапилляртә температура 275°C; ахҩа агаз ацара, 60 AU; ацхыраагӡатә газ ацара, 20 AU 300°C аҟны, насгьы S линза 60 AU ахь архиара.
13С ҳәа изышьҭоу аметаболитқәа рдыррақәа ранализ. Изотопқәа реизыҟазаашьа адыррақәа ранализ азы TraceFinder апрограмматә еиқәыршәара (версиа 4.2, Thermo Fisher Scientific) ахархәара. Еилаҵацыԥхьаӡа ахаҭара гәаҭан игәрагоу еиқәыршәагала, насгьы анализ ҟаҵан. Изотопқәа рбеиара анализ амҩаԥгаразы, 13С изотопқәа зегьы (Mn) рҟынтәи иҭгаз аионтә хроматограмма (XIC) аҭыԥ [M + H] + аҟынтәи иааган, уа n - ахықәкытә еилаҵа акарбонтә хыԥхьаӡара, аминоацидқәа ранализ азы ахархәара змоу, мамзаргьы [ MH] + анионқәа ранализ азы ахархәара змоу. XIC амассатә ҵабыргра миллионк аҟны хә-хәҭак еиҵоуп, RT аҵабыргра 0.05 минуҭуп. Абеиара анализ мҩаԥысуеит иԥшаау изотопцыԥхьаӡа аизотопқәа зегьы реизыҟазаашьа аԥхьаӡарала. Ари аизыҟазаашьақәа изотопцыԥхьаӡа апроценттә ҵакқәа реиԥш иаагоуп, насгьы алҵшәақәа раԥхьа ишҳәаз еиԥш молартә проценттә еиӷьтәра (МПЕ) ҳәа иаарԥшуп (42).
Ишьацыз анеуронтә пеллет ҵааҵас 80% аметанол (v/v) аҿы еиԥшны еиқәыршәан, еикәарҳәны -20°C аҟны 30 минуҭ рыла еиқәыршәан. Аҿырԥштәы даҽазнык еикәарҳәны +4°C 30 минуҭ рыла еиланарҩынтуеит. Аҿырԥштәы 21,000 г 5 минуҭ 4°C аҟны ацентрифуга аҭаны, анаҩс иалҵыз асупернатант еизганы SpeedVac концентраторла 25°C аҟны иҩан, анаҩстәи анализ азы. Хыхь ишҳәаз еиԥш, LC-MS анализ мҩаԥган еилыхыз ахәыцқәа рминоацидқәа рҿы. TraceFinder (версиа 4.2, Thermo Fisher Scientific) ахархәарала, еилаҵаны зегьы рмоноизотоптә масса ахархәарала адыррақәа ранализ мҩаԥган. Аметаболитқәа рдыррақәа рыквантильтә нормализациа мҩаԥган preprocessCore апрограммтә пакет (57) ахархәарала.
Аԥыҵәҵәа аҽазыҟаҵара. Аҳәынаԥ ирласны акарбон диоксид ала анаркоз азыруит, ахшыбаҩ ирласны ахыбаҩ аҟынтәи иҭыргеит, насгьы аҵаа иҭәыз абжьысратә ӷәы (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) рхы иадырхәеит 300 инаркны 375 μm carbon se2 CO2) Ҵаҟа Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натриум фосфат буфер, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-гликоза, 1.0 мМ CaCl2 и 6.0 мМ Adjust pH301 ахь. мОсм). Иҳауз ахшыбаҩ аҟәаҟәақәа еиҳа иҳараку Ca2 + ACSF зҭоу акамерахь ииагатәуп (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натриумтә фосфаттә буфер, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-гликоза, 4.0 мМ мМ Ca2l5C. насгьы 310 мОсм рҟынӡа). Аԥыҵәҵәақәа 20-30 минуҭк рыҩныҵҟа иҵәахтәуп, ҭаҩра ҟалаанӡа еиҭашьақәыргылахарц азы.
ақәҩыра. Аҭаҩрақәа зегьы рзы ахархәара аиоуит иҭышәынтәалоу аҭаҩратә камера змоу амикроскоптә сцена, насгьы 20x аӡы иҭарҵо аобъективтә линза (Scientifica). Пуркинье ихәыцрақәа рыхәҭақәа еилкаан (i) ацәеижь ашәагаа, (ii) ахшыбаҩ хәыҷы анатомикатә ҭыԥла, (iii) флуоресценттә mtYFP репортертә ген аҟазаарала. 5-11 мегом рҟынӡа аҵыхәа аҿагылара змоу апатч-пипетка боросиликаттәи ашәырӡтә капилляр (GB150-10, 0.86 мм×1.5 мм×100 мм, Science Products, Hofheim, Germany) ала иҭгахоит, насгьы игоризонталтә пипетка Instruments (P-1000), CA-1000). Аҭаҩрақәа зегьы мҩаԥган ELC-03XS npi патч-кламп амплификатор ала (npi electronic GmbH, Там, Германиа), уи анапхгара азҭон апрограмматә еиқәыршәара Signal (версиа 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Аԥышәара 12,5 кГц асамлинг амҽхак ала иҭаҩын. Асигнал еилырхуеит ҩ-фильтр кьаҿла ииасуа Бессельтәи афильтрқәа рыла, урҭ рыԥҟаратә лассы-лассыра 1,3 еиԥшны 10 кГц еиԥшуп. Амембранеи апипеткеи рҭаҵара амплификатор ахархәарала акомпенсациатә зегьеилазаарала ирцәыӡуеит. Аԥышәарақәа зегьы мҩаԥган Orca-Flash 4.0 акамера (Ҳамамацу, Герден, Германиа) анапхгара аҵаҟа, уи Hokawo апрограмматә еиқәыршәара анапхгара аҵаҟа иҟан (версиа 2.8, Хамамацу, Герден, Германиа).
Ацелл зегьы аконфигурациеи анализи. Аҭаҩра аламҭалазы, апипетка аҩныҵҟатәи ахҭәаала иҭәтәуп, абри аҩыза ахәҭақәа злоу: 4.0 мМ KCl, 2.0 мМ NaCl, 0.2 мМ EGTA, 135.0 мМ калиум глюконат, 10.0 мМ Hepes, 4.0 мМ ATPphotesine m (Na) и 10.0 мМ креатинин фосфат рН 7.25 ахь ирхиан, осмотикатә қәыӷәӷәара 290 мОсм (сахароза) ҟалеит. Амембран аԥжәаразы 0 рА амч аныҟаҵаха ашьҭахьҵәҟьа, аԥсшьаратә мембран апотенциал ашәара мҩаԥысит. Аҭагалара аҿагылара ршәоит -40, -30, -20, -10 рА ҳәа изышьҭоу агиперполяризациатә цәқәырԥақәа рыла. Ацәанырратә ҭакԥхықәра ашәагаа шьақәыргыланы, Ом изакәан ахархәарала аҭагалара аҿагылара аԥхьаӡара. Аспонтантә усура 5 минуҭк рыҩныҵҟа авольтажтә кламп аҿы иҭаҩын, sPSC еилкааны ишәан Igor Pro (версиа 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) абжа-автоматтә еилкааратә скрипт ахархәарала. IV ахәыи аҭышәынтәаларатә токи ршәоит акәалаԥ еиуеиԥшым апотенциалқәа рҿы ақәыргыларала (-110 мВ инаркны) насгьы 5 мВ ашьаҿақәа рыла ацәанырра аизырҳарала. АП аҟаҵара аԥышәара мҩаԥган адеполаризациатә цәаҳәа ахархәарала. Адеполаризациатә токтә импульс аныҟашәҵо, ацелл -70 мВ аҟны иарктәуп. Аҭаҩратә блокқәа зегьы ршьаҿа ашәагаа хазы-хазы еиқәыршәатәуп (10 инаркны 60 рА рҟынӡа). Иԥхьаӡатәуп AP иреиҳау ацәгьара, иреиҳау AP ацәгьара зырҿио апульстә шьапқәа напыла рыԥхьаӡарала. АП аҳәаа анализ азухоит адеполаризациатә импульс аҩбатәи ахылҵшьҭра ахархәарала, раԥхьаӡа акәны АПк ма еиҳаны еиҿызкаауа.
Иҭыҷҷаау аҟәаҟәа аконфигурациеи анализи. Истандарту апротоколқәа рыла иҭыҷҷаау апатчқәа рҭаҩра мҩаԥгатәуп. АТФ-и ГТФ-и злам апипетка ахархәара, анаҩстәи ахәҭақәа злам: 128 мМ агликонат К, 10 мМ КСl, 10 мМ Хепес, 0,1 мМ ЕГТА, 2 мМ MgCl2, насгьы pH 7,2 ахь ирхиатәуп (KOH ахархәарала). АТФи ГТФи ахәыцрақәа рыҩнуҵҟатәи ахҭышәҭраҿы иҭгахоит, ахәыцрақәа рмембран хылаԥшрада ацәылсра аԥырҟәҟәааразы. Апатч пипетка амфотерицин злоу аҩныҵҟатәи ахҭәаала иҭәуп (иаҳҳәап, 200-250мкг/мл; G4888, Sigma-Aldrich) апатч ҭаҩра аиуразы. Амфотерицин диметилсульфоксид аҿы иӡааҵан (аҵыхәтәантәи аконцентрациа: 0,1 инаркны 0,3% рҟынӡа; ДМСО; D8418, Сигма-Олдрич). Ахархәара змаз ДМСО аконцентрациа иҭҵааз анеуронқәа рҿы еиҳа анырра амамызт. Аҭҟәацра апроцесс аҿы, ацәаҳәа аҿагылара (Ra) еиԥмырҟьаӡакәа ахылаԥшра мҩаԥысуан, насгьы аԥышәара иалагеит Ra амплитуда AP ҭышәынтәаланы ашьҭахь (20-40 минуҭ). Аспонтантә усура ршәоит 2-5 минуҭк рыҩныҵҟа аволтаж мамзаргьы атоктә кламп ала. Адыррақәа ранализ мҩаԥган Игорь Про (версиа 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (версиа 2010, Microsoft Corporation, Редмонд, USA) иара убас GraphPad Prism (версиа 8.1.2, GraphPad Software Inc., Ла Џьолла, CA) рхы иархәаны. Еиду Аштатқәа). Аспонтантә АПқәа ралкааразы, IgorPro's NeuroMatic v3.0c аплагин ахархәара аиуеит. Автоматла иалкаатәуп APs иарбоу аҳәаа ахархәарала, уи хаҭала еиқәыршәоуп ҭаҩрацыԥхьаӡа. Аҵәҩан абжьаӡара ахархәарала, иалкаатәуп аҵәҩан лассы-лассы иреиҳау аамҭалатәи аҵәҩан лассы-лассыра, насгьы абжьаратәи ҵәҩанҵәы лассы-лассы.
PN аизоляциа. Уаанӡа икьыԥхьыз апротокол адаптациа аҭаны, PNs рыцқьан аҳәынаԥ ахшыбаҩ хәыҷы аҟынтәи иалкаау аҭагылазаашьаҿы (58). Иааркьаҿны иуҳәозар, ахшыбаҩ хәыҷы еиҟәырҟьеит, насгьы ҵааҵас ихьшәашәоу адиссоциациатә ҭагылазаашьаҿы [HBSS Ca2+, Mg2+ рыда, 20 мМ агликоза, апенициллин (50 У/мл) насгьы стрептомицин (0,05 мг/мл) рыла еиқәыршәаны], насгьы аҭагылазаашьа мгСС1, папалцистеин [ / мл), папаин (16 Е / мл) и дезоксирибонуклеаза I (ДНаза I; 0,1 мг/мл)] 30°C атемператураҿы 30 минуҭ рыҩныҵҟа ирыцқьатәуп. Раԥхьа ацәеижь ӡәӡәатәуп HBSS амедиум аҿы акәтаӷь ацәа (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) иара убас DNase (0.1 мг/мл) ауада аҳауа атемператураҿы, анзиматә рыцқьара аԥырҟәҟәааразы, нас HBSS амедиум аҿы 20 мМ агликоза злоу), ҟәымшәышәла ашьацҳәа HBlm0 (0,05 мг/мл) насгьы ДНаза (0,1 мг/мл) рыла ацәеижь заҵәык ҭрыжьуеит. Иалҵыз ахәҭақәа рсуспензиа 70мкм ахәҭақәа рыцқьага ала ирыцқьан, нас ахәҭақәа центрифугала (1110 rpm, 5 минуҭ, 4°C) еилыхратә ҭагылазаашьаҿы еиҭаҵан [HBSS, 20 мМ агликоза, 20% фетал бовиник) Ацәеижьтә шьаҭа, 20 (0,05 мг/мл)]; пропидиум иодид ала ахәыцқәа рыԥсҭазаара ахәшьара рыҭаны, ахәыцқәа рыҵарра 1×106 инаркны 2×106 ахәыцқәа/мл рҟынӡа ирхианы. Ацитометриа ацәырҵра аламҭалазы, асуспензиа 50 мкм ҟазшьа змоу ахәҭатә ӡәӡәага ала ирыцқьан.
Ацәырҵратә цитометр. Ахәыцрақәа реилыԥшаара 4°C аҟны имҩаԥган FACSAria III амашина (BD Biosciences) ахархәарала, насгьы FACSDiva апрограмматә еиқәыршәара (BD Biosciences, версиа 8.0.1) ахархәарала. Ацеллюляртә суспензиа еилыԥшаан 100 мкм ҵаҟа 20 psi ақәыӷәӷәара ҵаҟа ~2800 events/sec амҽхак ала. Атрадициатә шьаҿа акритериақәа (ахәыцрақәа ршәагаа, абимодальтә дискриминациа, аиԥхьырттаратә ҟазшьақәа) PN егьырҭ ахәҭа хкқәа рҟынтәи ииашаны аиҟәыҭхара рылымшо азы, шьаҭанкылатәи астратегиа шьаҭас иамоуп YFP интенсивреи автофлуоресценциеи ииашаны реиҿырԥшра mitoYFP+ ​​аҿы, насгьы MitoYFP - анапхгара. YFP 488 нм лазертә цәаҳәала аҿырԥшы ацәырҵрала игәыҭҟьоит, насгьы 530/30 нм диапазонтә фильтр ахархәарала асигнал ԥшаахоит. MitoYFP+ ​​аҳәынаԥқәа рҿы, Rosa26-mitoYFP репортертә ген аизыҟазаашьатә мчы ахархәара аиуеит анеуронтә цәеижьи аксонтә фрагментқәеи реилкааразы. 7-ААД 561 нм еиқәаҵәоу алазер ала игәыҭҟьоит, насгьы 675/20 нм змоу абандопропусктә фильтр ала иԥшаахоит, иԥсхьоу ахәҭақәа рыҭгара азы. Астроцитқәа еицырзеиԥшу аамҭазы реиҟәыҭхаразы, ахәҭақәа рсуспензиа ACSA-2-APC ала иҟәашьын, анаҩс аҿырԥшы 640 нм лазертә цәаҳәала иршәит, насгьы 660/20 нм бандопропусктә фильтр ахархәан асигнал аарԥшразы.
Еизгаз ахәыцқәа ацентрифуга ала (1110 rpm, 5 минуҭ, 4°C) пеллетла еиқәыршәан, ахархәара ҟалаанӡа -80°C аҟны иҵәахын. Mfn2cKO аҳәынаԥқәеи урҭ рхәыҷқәеи ҽнак ала еихшоуп, апроцедуратә ԥсахрақәа рмыцхәрас. FACS адыррақәа раарԥшреи анализ рыҭареи мҩаԥган FlowJo апрограмматә еиқәыршәара ахархәарала (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Хыхь ишҳәаз еиԥш (59), аамҭа ҭакԥхықәралатәи ПЦР ахархәара аиуеит еилыхыз анеуронқәа рҟынтәи ДНК аиҟәыҭхаразы, анаҩстәи мтДНК ашәагаа азы. Алинеаритети аԥынгылатә сенсибилизациеи раԥхьаӡа акәны еиуеиԥшым ахәҭақәа рҿы qPCR амҩаԥгарала иԥышәан. Ажәакала, 300 ПН еизганы 50 мМ трис-НСl (рН 8,5), 1 мМ ЕДТА, 0,5% Твин 20, протеиназа К (200 нг/мл) злоу лизистә буфер аҿы еизганы 55°С 120 минуҭ рыла инкубациа рзутәуп. Ахәыцқәа ҩаԥхьа 95°C аҟны 10 минуҭк рыла инкубациа рзуын, апротеиназа К инагӡаны инактивациа аҟаҵаразы. mt-Nd1 азы иҷыдоу TaqMan азонд (Thermo Fisher) ахархәарала, mtDNA 7900HT Real-Time SPCR система (Therificmosher) аҿы абжа-квантитативтә ПЦР ала ашәара мҩаԥган. Аҵарадырра, акаталог аномер Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Термо Фишер Саиентифик, акаталог аномер AIVI3E8) иара убас 18S (Термо Фишер Саиентифик, акаталог аномер Hs99999901_s1) генқәа.
Апротеом аҿырԥштәы азыҟаҵара. 95°C 10 минуҭ рыҩныҵҟа аӡы рԥхарала, насгьы ультразвукла, лизистә буфер аҿы [6 М гуанидин хлорид, 10 мМ трис (2-карбоксиетил) фосфин гидрохлорид, 10 мМ хлорацетамид, 100 мМ трис-НС пеллетқәа ҵаа нейрон аҿы]. Биоруптор аҿы (Диагенод) 10 минуҭк (30 секундтәи апульс / 30 секундтәи аҭакра аамҭа). Аҿырԥштәы 1:10 20 мМ трис-HCl (pH 8.0) аҿы иӡааҵан, 300 нг трипсин ахьы (Promega) еилаҭәаны, 37°C аҟны ҵхыбжьон инкубациа рзуын, инагӡаны ахәышәтәра ҟаларц азы. Аҩбатәи амш аҽны, аҿырԥшы 20,000 г 20 минуҭк рыла ацентрифуга ахь ирҭеит. Супернатант 0,1% форминтә ашьақарла иӡааҵан, насгьы ахҭышәҭра ҵаа рыцқьан ахатәы ҟаҵамҭа StageTips ала. Аҿырԥштәы SpeedVac аинструмент аҿы (Eppendorf концентратор плюс 5305) 45°C аҟны ирҩан, нас апептид 0.1% форминтә ашьақар аҿы иаанкылан. Аҿырԥштәқәа зегьы еицырхиеит аӡәы. Астроцитқәа рҿырԥштәқәа ранализ азы, 4 мкг ҵаа змам апептидқәа тандемтә массатә тег (TMT10plex, каталог номер 90110, Thermo Fisher Scientific) рыла еиқәыршәан, апептиди ТМТ реагенти реизыҟазаашьа 1:20 ҳәа. ТМТ амаркировка азы, 0,8 мг ТМТ реагент 70 мкл ӡы змам АСН аҿы еиҭаҵан, насгьы иҩаны иҟоу апептид 9 мкл 0,1 М ТЕАБ (триетиламмониум бикарбонат) еиҭашьақәыргылан, уи 7 мкл ТМТ реагент АСН аҿы иацҵан. Аконцентрациа 43,75% иҟан. минуҭк рыла аинкубациа ашьҭахь, 2 мкл 5% гидроксиламин ала ареакциа рцәеит. Иарбоу апептидқәа еизган, идырҩан, 200 мкл 0,1% форминтә ашьақар (FA) аҿы еиҭа иҭарҵон, ҩбаны еихшан, насгьы рхала иҟаҵаз StageTips ахархәарала ацәа рыцқьан. UltiMate 3000 ультра иҳараку аӡыхьтә хроматограф (UltiMate 3000 ультра иҳараку аӡыхьтә хроматограф) ахархәарала, аҩ-ганк рҟынтәи руак 130Å1.7μm C18 ахәҭақәа рыла иҭәыз 1мм х 150мм Acquity хроматографиатә колонкаҿы еихшан (NoWaters, catalog150). Термо Фишер Саиентифик). 30мкл/мин ацара амҽхак ала апептидқәа еиҟәыҭханы, 1% инаркны 50% рҟынӡа абуфер В 85 минуҭ рыла еиҟәыҭханы 96 минуҭ шьаҿа-шьаҿала, 50% инаркны 95% рҟынӡа абуфер В 3 минуҭ, нас 8 минуҭ 95 % Буфер В; Абуфер А 5% ACN и 10 мМ аммониум бикарбонат (ABC), а буфер В 80% ACN и 10 мМ ABC. минуҭ рышьҭахь афракциақәа еизганы ҩ-гәыԥкны еидҵаны (1 + 17, 2 + 18, уҳәа убас иҵегьы) вакуумтә центрифугаҿы ирҩоит.
LC-MS/MS анализ. Амассатә спектрометриазы, апептидқәа (ахыԥхьаӡара r119.aq) еиҟәыҭханы иҟан 25 см, 75 мкм аҩныҵҟатәи адиаметр змоу UcoFrit аналитикатә колонкаҿы (объективтә линза ҿыц, ахәҭа аномер PF7508250) 1.9 мкм ReproSil-Pur-Qrse, Mat120) рыла еиқәыршәаны. EASY-nLC 1200 (Термо Фишер Саиентифик, Германиа). Аколонна 50°C аҟны иаанкылан. Абуферқәа А, В 0,1% форминтә ашьақар аӡаҿы, 0,1% форминтә ашьақар 80% АСН аҿы, еиқәыршәаны. Апептидқәа 6% инаркны 31% рҟынӡа абуфер В 65 минуҭ рыла, 31% инаркны 50% рҟынӡа абуфер В 5 минуҭ рыла еиҟәыҭханы 200 нл/мин аградиент аманы. Елуированные пептиды анализированы на масс-спектрометре Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Апептидтә прекурсор м/з ашәара мҩаԥысуеит 120,000 ррезолюциала 350 инаркны 1500 м/з рҟынӡа. 27% анормализациа зызу аиҿагыларатә енергиа ахархәарала, 2-6 рҟынӡа аҭарҭәаратә ҭагылазаашьа змоу еиҳа иӷәӷәоу аԥхьагылаҩ алхуп енергиа ҳарак змоу С ацәҟьа адиссоциациа (HCD) аиҟәҟьаразы. Ацикл аамҭа 1 с еиқәыршәоуп. Апептидтә фрагмент m/z аҵакы ашәара мҩаԥган ионтә ҭаҟәаҿы иреиҵоу AGC ахықәкы 5×104 ахархәарала, насгьы иреиҳау аинжекциа аамҭа 86 мс ахархәарала. Аԥыҵәҵәара ашьҭахь, аԥхьагылаҩ 45 с динамикатә алхратә рсиаҿы иқәыргылан. ТМТ-ла иарбоу апептидқәа еиҟәыҭханы иҟан 50 см, 75 мкм ҟазшьа змоу Акклаим ПепМап абӷьыц аҿы (Термо Фишер Саиентифик, акаталог аномер 164942), насгьы амиграциатә спектрқәа анализ рзуын Орбитрап Лумос Трибридтәи амассатә спектрометр аҿы (Термо Фишер Саиентифилд-еквимметриатә массатә спектрометр ҳаракқәа рыла) (FAIMS) аиқәыршәара (Thermo Fisher Scientific) аус ауеит ҩ-компенсациатә еиҵаҟәаҟәарак рҿы −50 насгьы −70 В. Асинхронизациа аԥхьагылаҩ шьаҭас иҟаҵаны иалху MS3 ахархәара аиуеит ТМТ аҳасабырба ионтә сигнал ашәаразы. Апептидқәа реиҟәыҭхара мҩаԥган EASY-nLC 1200 аҿы, 90% линеартә градиенттә елиуциа ҳхы иархәаны, 6% инаркны 31% рҟынӡа абуфертә концентрациа змоу; буфер А 0,1% FA, буфер В 0,1% FA и 80% ACN. Аналитикатә колонна 50°C аҟны аус ауеит. Ихархәатәуп FreeStyle (версиа 1.6, Thermo Fisher Scientific) FAIMS акомпенсациатә еиқәыршәара инақәыршәаны оригинальтәи афаил аиҟәшаразы.
Апротеин аидентификациеи аԥхьаӡареи. Интегралтәу Андромеда аԥшааратә машьына ахархәарала, раԥхьатәи адыррақәа анализ рзуын MaxQuant версиа 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ахархәарала. Aequorea victoria аҟынтәи иаагоу Cre рекомбиназаи YFP еишьҭагылақәеи рыдагьы, апептидтә фрагментқәа рспектрқәа рыԥшаара мҩаԥган аҳәынаԥ аҵаҵӷәытә протеом аканонтә еишьҭагылаи аизоформтә еишьҭагылареи рзы (Proteome ID UP000000589, UniProt аҟынтәи ихәыҵаҳәҳәаз маи мзазы2020 азы. Метионин аксидациеи апротеин N-терминалтә ацетилациеи еиҭасуа амодификациақәа раҳасабала иқәыргылан; цистеин карбамоил метилирование было установлено как фиксированные модификации. Аӡәӡәара апараметрқәа шьақәыргылоуп “спецификациа” ҳәа “трипсин/Р” ҳәа. Апротеин аидентификациазы ахархәара змоу апептидқәеи аԥаҵаԥаҵатә пептидқәеи рминималтә хыԥхьаӡара 1 ауп; еиҵоу апептидқәа рыԥхьаӡа 0. Апептидтә карта аиқәшәара аҭагылазаашьақәа рҿы, апротеин аидентификациа аҩаӡара 0,01 иҟан. «Аҩбатәи апептид» ҳәа ахьӡ змоу аопциа аус ауеит. Еиуеиԥшым аоригиналтә фаилқәа рыбжьара еихьӡарала аидентификациақәа рыҭаразы “match entre runs” аопциа ахархәара. Ухы иархәа LFQ минимум рацио ԥхьаӡара 1 етикеткада ашәагаа азы (LFQ) (60). LFQ аинтенсивра еилырхуеит ҩ-ҵакык ракәзаргьы генотиптә гәыԥк иадамзаргьы еиуеиԥшым аамҭатә ҭыԥқәа рҿы, насгьы еиқәыршәоуп анормалтә еихшара аҟынтәи аҭбаара змоу. 0.3 насгьы ҵаҟа 1.8. Персеус аҳасабратә платформа (https://maxquant.net/perseus/) ахархәара, насгьы R (https://r-project.org/) LFQ аҵыхәтәақәа ранализ азы. Адиференциалтә ажәаҳәара анализ азы ахархәара аиуит ҩ-мҩактәи абжьаратәи t-тест limma программтә пакет аҟынтәи (61). Аԥшааратә дыррақәа ранализ мҩаԥысуеит ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally, pheatmap рыла. ТМТ-иқәыргыло апротеомикатә дыррақәа анализ рзуын MaxQuant версиа 1.6.10.43 ахархәарала. 2018 шықәса асентябрь мзазы ихәыҵаҳәҳәаз UniProt ауаҩытәыҩсатә протеомикатә дыррақәа рышьаҭа аҟынтәи апротеомикатә дыррақәа рыԥшаара. Адиференциалтә ажәаҳәара анализ азы R аҟны лимма ахархәара. Аоригиналтә дыррақәа, дыррақәа рышьаҭа аԥшаара алҵшәақәа, дыррақәа ранализ аусуратә еишьҭагылареи алҵшәақәеи зегьы ҵәахуп ProteomeXchange альянс аҿы PRIDE апартниортә ҭаҵәахырҭа абзоурала дыррақәа реизга аидентификатор PXD019690 аманы.
Афункционалтә аннотациақәа анализ дырбеиоит. 8-тәи абжьараҿы еизгоу адыррақәа рфункционалтә аннотациатә терминқәа рбеиара аилкааразы ахархәара аиуит Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ҳәа изышьҭоу аинструмент (Асахьа 1). Иааркьаҿны иуҳәозар, LC-MS/MS (тандемтә массатә спектрометриа) анализ аҟынтәи иаагоу апротеинқәа рсиа абарҭ афильтртә критериақәа рыла ахархәара аиуеит: Mus musculus алхуп ахкы еиԥш, насгьы акатегориа иаанарԥшуеит Benjamini 0.05 ма еиҵаны абеиара азы ирҽеиу P аҵакы. Абри аграфик азы, еиқәыршәоу Р аҵакы инақәыршәаны, акластерцыԥхьаӡа иреиҳау хә-категориак ацҵаны иаарԥшуп. Аӡәырҩы t-тест ахархәарала, Бенџамини, Кригер, Екутиели рыҩ-етапктәи линеартә еизҳаратә программа ахархәарала (Q = 5%), акатегориақәа зегьы рҿы иалкаау акрызҵазкуа акандидатцәа рҿы аамҭа-курстә протеинтә експресиа анализ мҩаԥысуеит, насгьы ацәаҳәақәа зегьы хазы-хазы анализ рзухоит. Иаҭахӡам еиқәшәоу SD ақәыргылара.
Ари ҭҵаара аҵыхәтәақәа икьыԥхьу адыррақәа рышьаҭақәа ирыҿҳарԥшырц, насгьы асахьа 1 аҿы иаагоу Венн идиаграмма аԥҵаразы, ҳара еидаҳкылеит ахаҭәааратә протеинқәа рсиа MitoCarta 2.0 аннотациақәа рыла (24). Адиаграмма аԥҵаразы онлаинтәи аинструмент Венн идиаграмма асахьа ҭых (http://биоинформатика.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ахархәара.
Апротеомикатә анализ азы ахархәара змоу астатистикатә процедурақәа ирызкны еиҳаны адырра аиуразы, аҳәара ҟаҳҵоит, Материалқәеи аметодқәеи рҟны иҟоу аҟәшаҿы шәахәаԥш. Егьырҭ аԥышәарақәа зегьы рзы, инарҭбаау адыррақәа рыԥшаара ауеит иақәшәо ​​алегендаҿы. Даҽакала иарбамзар, адыррақәа зегьы еиҳарак ± SEM ҳәа иаарԥшуп, насгьы астатистикатә анализқәа зегьы мҩаԥган GraphPad Prism 8.1.2 апрограмматә еиқәыршәара ахархәарала.
Ари астатиа азы иацҵоу аматериалқәа рзы шәахәаԥш http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1.
Ари иаарту анеирҭа змоу статьоуп, Creative Commons Attribution-Non-Commercial License аԥҟарақәа рыла ирылаҵоуп, уи иарбанзаалак амедиум ахархәара, аларҵәара, аиҭаҭыжьра азин анаҭоит, аҵыхәтәантәи ахархәара акоммерциатә феида азы акәымзар, насгьы аоригиналтә усумҭа иашазар. Азхьарԥш.
Агәынкылара: Ҳара шәара шәе-маил адрес шәҳәарц мацара ауп иҳаҳәо, адаҟьахь ишәыдышәкыло ауаҩы еиликаарц азы, е-маил ибарц шышәҭаху, насгьы уи спам шакәым. Ҳара е-маил адресқәак ҳҭакыӡом.
Ари азҵаара ахархәара амоуп уара уҭааҩу-уҭааҩу агәаҭаразы, насгьы автоматикала аспам ашьҭра аԥырҟәҟәааразы.
Е. Мотори, И. Атанасов, С.М.В. Кочан, К. Фольц-Донахуе, В. Сактивелу, П. Джиавалиско, Н. Тони, Џь. Ларсон
Адисфункционалтә нейронқәа рпротеомикатә анализ иаанарԥшит анеуродегенерациа аҿагыларазы аметаболизмтә программақәа шыҟоу.
Е. Мотори, И. Атанасов, С.М.В. Кочан, К. Фольц-Донахуе, В. Сактивелу, П. Джиавалиско, Н. Тони, Џь. Ларсон
Адисфункционалтә нейронқәа рпротеомикатә анализ иаанарԥшит анеуродегенерациа аҿагыларазы аметаболизмтә программақәа шыҟоу.
©2020 Аҭҵаарадырра аҿиаразы Америкатәи Ассоциациа. зегьы рзинқәа хьчоуп. АААС ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ХОРУС, КЛОКСС, КроссРеф, КАУНТЕР рпартниоруп. АҵарадырраАҿиарақәа ISSN 2375-2548.