Уажәы†Уажәтәи адрес: OX11 0DE, UK, Даймонд Билдинг, Харвелл Аҭҵаареи Аинновациатә Парк, Диеткот, Оксфордшир, UK, Даймонд Лайт Сорс Ко., Лтд., Аелектронтә Биологиатә Асахьаҭыхратә Центр.
Ареакциатә центр алашара еизызго акомплекс 1 (RC-LH1) ацәаԥшь ԥштәы змоу афототрофтә бактериақәа рфотосинтезтә компонент хада ауп. Ҳара Rhodopseudomonas palustris аҟынтәи RC-LH1 акомплекс акрио-електронтә микроскоптә структурақәа ҩба ҭаҳгалеит. RC-LH114-W акомплекс 2.65-Å резолюциатә структура RC иаарыкәыршоу 14 субединица LH1 ацәаҳәақәа рыла ишьақәгылоуп, уи апротеин W иаԥырҟоит, аха апротеин-W змам акомплекс RC иакәыршоу RC еилазаароуп. Иаркуп 16 субединица LH1 ацәаҳәа. Абарҭ аилазаашьақәа реиҿырԥшра RC-LH1 акомплекс аҿы ахинон адинамика аилкаара ҳнаҭоит, RC QB аҭыԥ аҿы ахинон анеидҳәалоу уаанӡа изыԥшаамыз аконформациатә ԥсахрақәа уахь иналаҵаны, иара убасгьы ацхыраагӡатә хинон аимадаратә ҭыԥқәа ахьыҟоу, урҭ RC ахь рыҭараҿы ицхраауа. W апротеин иҷыдоу аилазаара LH1 ацәаҳәа аркра иаԥырхагоуп, уи ала хинон/хинолон аимдара арццакразы амҩа аԥҵара.
Афотосинтез иаҳнаҭо амч адгьыл аҿы иҟоу аԥсҭазаара зегьы еиқәнархоит, насгьы уи амратә биотехнологиазы алшара дуқәа амоуп. Адунеизегьтәи афотосинтез ацхраараан, ацәаԥшь еиԥшу афототрофтә бактериақәа еиуеиԥшым аенергиатә ҟазшьақәеи аметаболизмтә лшарақәеи аадырԥшуеит. Урҭ афотосинтез рҽацәырыхьчар рылшоит, насгьы алашьцара аҿы агетеротрофтә бактериақәа реиԥш еизҳауеит, азоти акарбон диоксиди рырӷәӷәара рылшоит, аҳаидроген ҟарҵоит, насгьы ароматтә еилаҵақәа рыԥхасҭартәуеит (1—3). Арҭ апроцессқәа рзы аенергиа аиқәыршәаразы, алашара ирласны, насгьы еффективла ахимиатә енергиахь ииагатәуп. Ари апроцесс алагоит алашара аанызкыло антеннатә комплекс алашара анҭанакыло, насгьы иҭакыз аенергиа ареакциатә центр (РЦ) ахь ианиҭо, убас ала азарџь аилыхра аналагалак (4 – 7). Аԥштәы ҟаԥшь змоу афототрофтә бактериақәа рҿы афотосинтез ашьаҭатә еизак 2-тәи RC хкы ала ишьақәгылоуп, уи алашара еизызго акомплекс 1 (LH1) иакәыршоуп, RC-LH1 акомплекс хада шьақәзыргыло. LH1 еиҿкаауп αβ гетеродимерқәа рыла, урҭ зегьы ҩ-бактериатә хлорофилл (BChl) амолекулақәеи, акы-ҩба каротиноидқәеи еидҳәалоуп (8-12). Иаҳа имариоу LH1 антенна 16 мамзаргьы 17 αβ гетеродимерқәа рыла ишьақәгылоуп, урҭ RC (9-13) иакәыршоуп, аха егьырҭ акомплекс хадақәа рҿы, трансмембрантә пептидқәа иаакәыршаны иҟоу LH1 еиԥмырҟьоит, Убас ала хинол/хинонтә диффузиа bRC1, 13—15). Аԥштәы ҟаԥшь змоу афототрофтә ҵиаа Rhodopseudomonas (Rps.) афотосинтез иацхраауа аенергиеи аелектронқәеи реиҭагара еилызкаауа аорганизм ҿырԥшуп. Рпс актәи акристаллтә структура. Палустрис RC-LH1 акомплекс амодел RC ауп, 15 гетеродимертә LH1 ацәаҳәақәа рыла иаакәыршоуп, урҭ еилымкаау “Протеин W” ҳәа изышьҭоу апротеин ала иԥырҟоит (14). Апротеин-W анаҩс RPA4402 ҳәа иалкаан, уи 10.5кДа характеристика змам протеинуп, х-трансмембрантә спиральк (ТМХ) змоу (16). Ҳара иҳаԥхьаӡоит rpa4402 ген апротеин W еиқәзыршәо pufW ҳәа ахьӡ ԥсахра, RC-L, M (pufL, pufM) еиԥш LH1α, β (pufA, pufB) субединицақәа еиқәзыршәо агенқәа рзы ахархәара змоу аноменклатура иақәшәартә еиԥш. Уи адагьы, апротеин-W RC-LH1 10% ҟынӡа мацара ауп иахьыҟоу, Rps аазырԥшуа. palustris еиуеиԥшым ҩ-комплекск RC-LH1 ҭнаҵоит. Абраҟа ҳара ҳҳәоит ҩ-комплекс хадак рыҟнытә еиҳа иҳараку аилкаара змоу акрио-ЕМ (крио-ЕМ) структурақәа, акы апротеин W аманы, 14 αβ гетеродимерс аманы, аҩбатәи апротеин W амаӡамкәа, насгьы иарку 16 Гетеродимер LH1 ацәаҳәа. Ҳара ҳструктура иаанарԥшуеит Rps RC-LH1 комплекс аилкаараҿы ашьаҿатә ԥсахра. palustris, избан акәзар ҳара анализ ҟаҳҵеит вариантцыԥхьаӡа иеиԥшу апопуляциа, насгьы ҳара иҳамоуп иахәҭоу аӡбара, еилыкка апептидқәеи еидҳәалоу апигментқәеи, урҭ ирыдҳәалоу алипидқәеи ахинонқәеи рыҭаразы. Абарҭ аилазаашьақәа реиҿырԥшра иаанарԥшуеит, уажәраанӡа даҽа RC-LH1 комплекск аҿы иԥшаамыз х-TMH протеин-W х-протеинк хинон/хинолон аимдара арццакразы хинонтә канал шыҟарҵо. Иҟоуп еиқәырхаз алипидқәеи ахинонқәеи рыбжьаҵаратә ҭыԥқәа ԥыҭрак, насгьы ҳара иааҳарԥшит аконформациатә ԥсахра ҿыц хинони RC реилаҵара ашьҭахь, уи аксиген змоу афототрофтә организмқәа рфотосистема II (PSII) RC азы ианаалозар ауеит. Ҳара иҳаԥшааз адыррақәа ҿыцқәа ҳзаанагоит ахинон/хинолон реидҳәалареи реиҭныԥсахлареи ркинетика азы RC-LH1 ԥшьа-ԥшьа фототрофтә бактериақәа ркомплекс хадаҿы.
Рпс. palustris, ҳара RC-LH1 зегьы биохимиатә методқәа рыла иалҳхуеит. Апротеин W-дефициттә комплекс (анаҩс ΔpufW ҳәа изышьҭоу) pufW ген змам аштамм аҟынтәи ирыцқьан (16), насгьы RC-LH1 комплекск мацара ауп иҟаҵахо. Апротеин W-злоу акомплекс аштамм ала иҭрыжьуеит. Ари аштамм апротеин W 10x His атег ала иԥсахуеит иара С-терминал аҿы, убас ала апротеин W злоу акомплекс еиҳарак иҟам апротеин W ибзианы еидҵазар алшоит, аметалл иммобилизациа аҭарала. Акомплекс ибзианы еиҟәыҭхоуп (16) Аффинтә хроматографиа (IMAC).
Асахьа 1 аҿы ишаабо еиԥш, аҩ-комплекск рҿы х-еидкылак RC (RC-L, RC-M, RC-H) ыҟоуп, урҭ LH1 антеннала иаакәыршоуп. Апротеин-W змам акомплекс 2.80-А аструктура 16 αβ гетеродимерқәа аанарԥшуеит, RC зегьы иаарыкәыршоу LH1 ацәаҳәа шьақәзыргыло, анаҩс RC-LH116 акомплекс ҳәа изышьҭоу. Апротеин-W зҵоу акомплекс 2.65Å аструктура 14-гетеродимер LH1 амоуп, уи апротеин-W ала иԥырҟоит, анаҩс RC-LH114-W ҳәа иашьҭоуп.
(А и Б) Акомпоунд аҿықәтәи аарԥшра. (С и Д) Акәадырқәа рыла иаарԥшу еидҳәалоу апигментқәа. (Е и F) Ацитоплазматә хыхьчара аҟынтәи иубаратәы иҟоу акомплексқәа рҿы амультфильмқәа рҿы иаагоу апептидқәеи LH1 субединицақәеи ыҟоуп, насгьы урҭ апротеин-W абжьаӡра аҟынтәи асааҭ ахь аномер рыҭоуп [Rba аномерқәа ирықәшәоит. сфероидқәа ркомплекс (13)]. LH1-α азы, апротеин асубединица аԥштәы ҟаԥшьуп; LH1-β азы, апротеин асубединица аԥштәы шьацԥшшәуп; апротеин-W азы, апротеин ҟаԥшьуп; RC-H азы, уи сиануп; RC-L азы, уи Оранж ауп; RC-M азы, амагента. Акофакторқәа аҵәҩанқәа рыла иаарԥшуп, аҵиаҵәа иаанарԥшуеит BChl, BPh a амолекулақәа, аԥштәы ҟаԥшь иаанарԥшуеит акаротиноидқәа, аҵәа иаанарԥшуеит UQ10 амолекулақәа. (G и H) RC-LH114-W комплекс (G) и RC-LH116 комплекс (H) еиҟароу аҭыԥ аҿы апротеин-W абжьаӡра ирдуу ахәаԥшышьа. Акофакторқәа аҭыԥ аҭәра еиԥш иаарԥшуп, ахелаттә хинон ашәиаҵәала иаарԥшуп. Апротеин-W абжьаӡра (G) аҟны ацәаҳәа шьацԥшшәыла иалкаауп, насгьы LH116 ацәаҳәаҿы хинон/хинолол ахьрылаҵәо аҭыԥ хәыҷқәа (H) аҟны ацәаҳәа еиқәаҵәала иалкаауп.
Асахьа 1 (А, В) иаанарԥшуеит RC иаарту ма иарку LH1αβ гетеродимерқәа рыла иаакәыршоу, урҭ зегьы ҩба BChl еиԥш каротиноидк еидҳәалоуп (Асахьа 1, С, D). Уаанӡатәи аҭҵаарақәа иаадырԥшит Rps LH1 комплекс шакәу. Спирулина ксантин абиосинтезтә мҩаҿы, абарҭ ахкқәа каротиноидқәа еилаԥсоу рпопуляциақәа рымоуп (17). Аха, спиропирроксантин еиҳа ихадоу каротиноидуп, насгьы уи аҵарра угәы иақәшәоит. Убри аҟнытә, ҳара иалҳхит LH1 еидызкыло аҭыԥқәа зегьы рҿы спироксантин амодель ҟаҵара. Альфа-бета полипептидқәа TMH-қәа роуп, рыдәахьтәи амембран кьаҿқәа змоу (Асахьа 1, А, В, Е, F). С-терминал аҿы 17-тәи аԥсыбаҩқәа рыҭбаара ҳәа акгьы умбазаргьы, альфа-полипептид акомплексқәа рыҩбагьы рҿы Met1 инаркны Ala46 ахь еиҟәыҭханы иҟан. β полипептид RC-LH116 аҿы Gly4 ахьтә Tyr52 ахь, RC-LH114-W аҿы Ser5 ахьтә Tyr52 ахь еиҵахеит. мамзаргьы 4 N-терминалтәи мамзаргьы 13 C-терминалтәи аԥсыбаҩқәа рыҵарра ҳәа акгьы убаратәы иҟамызт (Асахьа S1). Абнатә хкы змоу аштамм аҟынтәи иазыҟаҵоу еилаԥсоу RC-LH1 акомплекс амасс-спектрометриатә анализ иаанарԥшит, ибжьаӡыз аҭыԥ абарҭ апептидқәа ргетерологтә еиҟәҟьара иалҵшәаны ишыҟаз (Асахьа S1, S2). α-Met1 N-терминалтә формилированиегьы гәаҭан (f). Анализ иаанарԥшит α-пептид fMet1 инаркны Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 рҟынӡа аԥсыбаҩқәа рыла ишышьақәгылоу, β-пептид Ser2 инаркны Ala53 рҟынӡа аԥсыбаҩқәа рыла ишышьақәгылоу, уи атемпература лаҟә змоу ЕМ аҭацәратә карта ибзианы иақәшәоит.
α-His29 и β-His36 ркоординациа BChls лабҿаба еиқәнаршәоит; αβ гетеродимер зегьы ргәылацәа ирыцны еизоит иаарту ацәаҳәа (RC-LH114-W) ма иарку ацәаҳәа (RC-LH116) RC иаакәыршаны Аекситон еидҳәалоу апигменттә массив (Асахьа 1, С, Д). RC-LH114-W 877 нм абанд еиҿырԥшны, RC-LH116 880 нм абсорбциа ҟаԥшь аиҭасра 3 нм ауп (Асахьа 2А). Аха дихроизм акәымпыл аспектр еиԥшуп ҳәа ҳҳәар ҳалшоит (Асахьа 2В), уи иаанарԥшуеит иаартуи иаркуи ацәаҳәақәа рыбжьара еилыкка еиԥшымзаара шыҟоугьы, БЧлс рҭыԥантәи аҭагылазаашьа даара ишеиԥшу. Абсорбциатә ҟаԥшьтә еиҭасра ҟалар алшоит аԥхарратә ҵысра аиҵахара, насгьы иарку ацәаҳәаҿы аҭышәынтәалара аизырҳара (18, 19), иарку ацәаҳәа иахҟьаны апигменттә еиқәыршәара аԥсахра (20, 21), ма абарҭ аҩ-еффектк реилаҵара (11).
(А) Аультрафиолеттә/иубарҭоу/инфраҟаԥшь азааигәоу абсорбциа аспектр, урҭ рықәцәқәа ирықәшәо ​​апигментқәа рыла иарбоуп, насгьы 775 нм аҟны BPh ақәцә ахь инормалтәуп. (Б) Агьежьтә дихроизм аспектр 805 нм аҟны BChl абсорбциа ахь инормалтәу. (С и D) RC-LH114-W комплекс (C) и RC-LH116 комплекс (D) аамҭала иӡбахо абсорбциатә спектрқәа рҟынтәи иалху ΔA спектрқәа. Еиӷьны аиҿырԥшразы, аспектрқәа зегьы ∆A −A 0.2 ps аҟны инормалтәуп. (Е) Ацитохром с2 аксидациа амҽхак иррадиациа ашьҭахь еиуеиԥшым аконцентрациақәа UQ2 ыҟаны (иахәаԥш асахьа S8 амхәыцтә дыррақәа рзы). (F) Илаҟәу, ибжьаратәу, мамзаргьы иҳараку алашара ҵаҟа иааӡоу ахәыцрақәа рҿы (10, 30 мамзаргьы 300мкМм-2 с-1, еиқәыршәаны), ирыцқьоу акомплекс аҿы иҟоу апротеин W, RC-L субединицақәеи, еиҟәыҭханы иҟоу амембранатә еизыҟазаашьақәеи. Апротеин аҩаӡара еилкаатәуп SDS-полиакриламидтә гелтә электрофорези аиммуноанализи рыла (иахәаԥш асахьа S9 амхәыцтә дыррақәа рзы). Ирыцқьоу RC-LH114-W акомплекс ахь аизыҟазаашьа шьақәыргылатәуп. Акомплекс RC-L апротеин-W астоехиометриатә еизыҟазаашьа 1:1 ауп.
1-тәи аҭыԥ аҿы иҟоу BChls RC-LH114-W (Асахьа 1, А, С, Е) RC раԥхьатәи адонор (Р) еиҳа изааигәоуп RC-LH116 аҿы иҟоу еиҟароу BChls раасҭа (Асахьа 1, В, S3); аха аҩ-комплекск рҭагылазаашьатә абсорбциатә кинетика иаанарԥшуеит RC-LH114-W RC-LH116 рзы, LH1 инаркны RC ахь агәыҭҟьаратә енергиа аиагара аамҭа аконстантақәа 40 ±4 насгьы 44±3 ps шракәу (Асахьа 2). , C и D, Асахьа S4 и Аҭаӡҩыра S2). Иара убасгьы RC аҩнуҵҟа аелектронтә еиҭагараҿы еиҳау еиԥшымзаара ыҟам (Асахьа S5 насгьы уи иадҳәалоу ацҵаратә текст). Ҳара ҳгәы иаанагоит, LH1 RC-P рыбжьара аенергиа аиагара аамҭа аизааигәара зыхҟьо LH1 аҩ-цәаҳәак рҿы BChl еиҳарак рыбжьара абжьаӡара, акәакь, апотенциалтә енергиа еиԥшуп ҳәа. Иҟалап, LH1 аенергиа ахсаала аҭҵаара, еиҵаӡоу абжьаӡара анаӡаразы, субоптималтә ҭыԥқәа рҟынтәи RC ахь ииашаны аенергиа аиагара аасҭа еиҳа иццакӡом. RC-LH114-W аҟны иаарту ацәаҳәа LH1 ацәаҳәа аструктуратә анализ азы еиҵоу атемпература аҭагылазаашьақәа рҿы ҵакы змам аԥхарратә ҵысра ахысра алшоит, насгьы RC 1 аҭыԥ аҿы иҟоу βBChls рпигментациатә хара аҟынтәи ауада атемператураҿы еиҳа инаӡоу αβ14 ацәаҳәа аконформациа ыҟоуп.
RC-LH116 акомплекс 32 BChls 16 каротиноидқәа аҵоуп, насгьы уи аиҿкаара иааизакны еиԥшуп Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Протеинтә дыррақәа рбанк (PDB) ID 5Y5S] (9), Тиорходовибрион IDC7T9r. (12) насгьы аӡҵаа иаҵәа (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Аиқәыршәара ашьҭахь, αβ гетеродимерқәа рҭыԥқәа рҿы еиҭакра маҷқәак роуп иубаратәы иҟаз, ҷыдала 1-5, 15, 16 (Асахьа S6). Апротеин-W аҟазаара LH1 аилазаараҿы анырра ду анаҭоит. Иара х-ТМХк еидҳәалоуп ацәаҳәа кьаҿқәа рыла, акомплекс алумен аганахьала N-терминал, ацитоплазма аганахьала С-терминал (Асахьақәа 1А, 3, А инаркны Д рҟынӡа). Апротеин-W еиҳарак аӡы ацәымӷуп (Асахьа 3В), TMH2, TMH3 LH1αβ-14 еидгылоит, трансмембрантә хыхьчара шьақәдыргылоит (Асахьа 3, В, Е инаркны G рҟынӡа). Аинтерфеис еиҳарак трансмембрантә регион аҿы иҟоу Phe, Leu, Val рыԥсыбаҩқәа рыла ишьақәгылоуп. Урҭ аԥсыбаҩқәа аӡы зцәымӷу аминоацидқәеи αβ-14 пигментқәеи рыла еиқәыргылоуп. Зны-зынла аполяртә ԥсыбаҩқәагьы аидгылара рхы аладырхәуеит, урҭ рҟны иҟоуп W-Thr68 еиԥш β-Trp42 рыбжьара иҟоу аҳаидрогентә еимадара, еилацәажәо аҭыҳәҭа аҿықәан (Асахьа 3, F, G). Ацитоплазма аҿықәан, Gln34 αβ-14 каротиноидқәа ркето-гәыԥ иазааигәоуп. Уи адагьы, n-додецил β-d-малтозид (β-DDM) амолекула ӡбахеит, насгьы уи аӡы зцәымӷу аҵыхәа апротеин-W еиԥш αβ-14 рыбжьара иҟоу аинтерфейс аҟынӡа инаӡеит, насгьы алипидтә мҵәыжәҩа ацәеижь аҿы иҟазар ауеит. Ҳара иара убас игәаҳҭеит, апротеин W, RCH р-С-терминалтә резолюциатә регионқәа даара ишааигәоу, аха иҷыдоу аидҳәаларақәа рышьақәгылара аҳәаақәа ирҭагӡаны ишыҟам (Асахьа 1, А, Е). Аха, абарҭ аҩ-протеинк рыӡбам С-терминалтә аминоацидқәа рҿы аидгылара ыҟазар ауеит, уи RC-LH114-W акомплекс аизгараан апротеин-W аҭагалара амеханизм еиқәнаршәар алшоит.
(А) Апротеин-W, амультфильмтә формаҿы LH1αβ14 аинтерфейс иаҿаԥшуа, аганахьтәи аганахьтәи ацәаҳәа (аҟаԥшь) амоуп, уи аелектростатикатә потенциал адиаграмма ахәҭак аҿы иаарԥшуп (0,13 ҳәа аконтур аҩаӡара змоу иҵәцароуп). (Б) Апротеин-W аӡы зцәымӷу ԥштәыла иҟоу аҿықә ала иаарԥшуп. Аполяртәи аҭарҭәаратәи аҭыԥқәа асиан ԥштәыла иаарԥшуп, аӡы зцәымӷу аҭыԥқәа шкәакәала, ӷәӷәала аӡы зцәымӷу аҭыԥқәа апурпур ԥштәыла иаарԥшуп. (С и Д) Апротеин-W амультфильм аҿы иарбоу, уи аориентациа (А) (С) аҿы иаагоу еиԥшуп, насгьы 180° (Д) ирҵәиуеит. Аишьҭагылаҿы иҟоу аҭыԥ инақәыршәаны, еилкаахо аԥсыбаҩқәа ацәаҟәа аԥштәы схема рыдыркылоит, уа N-терминал шьацԥшшәылоуп, С-терминал ҟаԥшьуп. (Е) Апротеин-W (А) аҿы иаагоу ахәаԥшышьала, насгьы апротеин-W:LH1 аинтерфейс аҿы иҟоу аԥсыбаҩқәа аарԥшуп адыргақәа зқәырҵо акаҵкәырқәа рыла. (F) Апротеин-W 90° еикәарҳәуп (E) еиԥш LH1αβ14 амультфильм аарԥшраҿы, насгьы абар аарԥшраҿы аинтерфеис аԥсыбаҩқәа ирызкны. Абета-полипептид аҟынтәи иқәыԥсоу аԥсыбаҩқәа рхы иадырхәоит. Акофактор аагоуп асахьа 1 аҿы иаагоу аԥштәы иақәшәо ​​абара еиԥш, еилаԥсоу β-DDM аагоуп ашәиаҵәала, ахәышәтәыга аарԥшуп аҟаԥшь ала. (G) (F) аҿы иаагоу 180° еикәарҳәуп, альфа-полипептид ҳәа изышьҭоу аԥсыбаҩқәа рыла.
Апротеин-W αβ гетеродимер ԥсахуеит (15-тәи асахьа 1F аҿы), уи ала ацәаҳәа аиқәыршәара аԥырхагахоит, насгьы раԥхьатәи х-гетеродимерк рыхәара ԥырхагас иҟанаҵоит. Иазгәаҭан, актәи αβ-1 гетеродимер амаксимумтәи анаара акәакь акино анормалтә еиҿырԥшны 25° инаркны 29° рҟынӡа ишыҟаз (Асахьа 1, А и Е), уи αβ-1 2° инаркны 8° рҟынӡа анаара RC A sharp contrast-LH116 and F (Асахьа 1, B) аҿы ишьақәгылеит. Аҩбатәии ахԥатәии агетеродимерақәа 12° инаркны 22° рҟынӡа, 5° инаркны 10° рҟынӡа иҟәаҟәоуп. RC астерикатә ԥынгыла амзыз ала, αβ-1 анаара аҩбатәи αβ ҩыџьа аҵанакуам (16-тәи αβ асахьа 1F аҿы иақәшәо), убас ала LH1 ацәаҳәаҿы еилыкка абжьаӡра шьақәнаргылоит (Асахьа 1, А, Е) . Ҩ-αβ гетеродимерқәа рыҟамзаара иахҟьаны, ԥшь-BChl ҩ-каротиноидк рыӡра ацны, акаротиноидқәа рҟынтәи аӡәгьы еикәарҳәу αβ-1 субединица иадҳәалаӡом, уи иахҟьаны LH114-W ацәаҳәа ҟалоит, 13 каротиноид Вегетариантәи 28 BChl зҵоу. αβ1 7-тәи арегионқәа рҿы иҟоу аҩ-комплекск рҭыԥантәи аӡбара ахәшьарақәа LH1 ацәаҳәа иаанхаз раасҭа еиҵоуп, уи RC QB асаит иазааигәоу LH1 субунит ацәеижьтә пластичность аанарԥшыр алшоит (Асахьа 4) .
RC-LH114-W (А и В) и RC-LH116 (С и Д) рсахьа еиԥшны иаарԥшуп хыхьтәи/ганахьтәи ахәаԥшышьа (А и В) (А и С) еиԥш асахьа 1. (В и Д). Аԥштәы змоу ацаԥхақәа арӷьарахь иаарԥшуп.
1:14 стоехиометриатә еизыҟазаашьа змоу даҽа характеристикатә ҵаҵӷәытә комплекск заҵәык ауп Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX димер (13). Аха, апротеин W еиԥш PufX еилыкка иҟоу ахомологиа рымаӡам, насгьы р-LH1 структурақәа рҿы анырра ду рымоуп. PufX - ари N-терминалтәи ацитоплазматә домен змоу ТМХ заҵәык ауп, уи RC-H субунит (13) ацитоплазматә ган Rps иақәшәо ​​аҭыԥ аҿы еидгылоит. палустрис LH116αβ-16. PufX RC-LH1 ацитохром bcl комплекси рыбжьара хинон/хинолон аиҭныԥсахларазы ацәаҳәа аԥҵоит, насгьы Rba зегьы рҿы иҟоуп. сфероидқәа ркомплекс ҵаҵӷәы (13). Амономер-мономертә интерфеис Rba аҟны ишыҟоугьы. Сфаероидқәа RC-LH1-PufX адимер RC-LH114-W аҿы апротеин W еидызкыло аҭыԥ аҿы иҟоуп, насгьы PufXи апротеин-Wи ирызцәырҵуа абжьаӡра еиҟароу аҭыԥ аҿы иҟоуп (Асахьа S7A). RC-LH114-W аҟны иҟоу агәыҩбара Pseudomonas rosea LH1 агипотетикатә хинонтә канал (8) иақәшәоит, уи апротеин W ма PufX иадҳәалам апептидқәа рыла ишьақәгылоуп (Асахьа S7B). Уи адагьы, Blc аҟны иҟоу хинонтә канал. γ субединицак (7) аламҵакәа ишьақәгылоу изумруд иаҵәа LH1 еиԥшу аҭыԥ аҿы иҟоуп (Асахьа S7C). Еиуеиԥшым апротеинқәа рыла еиқәыршәазаргьы, RC-LH1 акомплекс аҿы еицырзеиԥшу аҭыԥ аҿы абарҭ ахинон/хинололтә каналқәа рцәырҵра конвергенттә еволиуциа аҿырԥштәы акәны иҟоуп, уи иаанарԥшуеит апротеин W иаԥнаҵо абжьаӡра хинонтә каналҵас аус шауа.
LH114-W ацәаҳәаҿы иҟоу абжьаӡра алнаршоит RC-LH114-W акомплекс аҩныҵҟатәи аҭыԥи амембран дуи рыбжьара еиԥмырҟьо амембранатә ҭыԥ аԥҵара (Асахьа 1G), апротеинқәа рҿы еиԥш аҩ-доменк апротеинтә ҭыԥ ала реидҵара аасҭа. RC-LH116 акомплекс еиԥшуп иарку Tch. Асахҭа еиԥшу акомплекс (22) (Асахьа 1Н). Хинон амембрана ала адиффузиа еиҳа иццакуеит апротеинтә канал ҭшәа ала адиффузиа аасҭа, иаарту LH114-W ацәаҳәа RC еиҳа ирласны аиҭасра алнаршоит иарку LH116 ацәаҳәа аасҭа, насгьы хинон RC ахь адиффузиа еиҳа иԥкхар ауеит. Апротеин W RC ала хинонқәа рыԥсахра ианыруа-ианыруаму агәаҭаразы, ҳара цитохромтә оксидациатә анализ мҩаԥаҳгеит убихинон 2 (UQ2) (ԥсабаратә UQ10 аналог, еиҳа икьаҿу изопрентә мҵәыжәҩа змоу) (Асахьа 2Е). Хелаттә хинон аҟазаара еилкаау Михаэлис иконстанта ииашаны аилкаара иаԥырхагазаргьы (RC-LH114-W и RC-LH116 0.2±0.1мкМ и 0.5±0.2мкМ рзы ианаалоит), RC-LH2.RC-6-1 (e.RC114-1) иреиҳау аҩаӡара ауп. 28±5% еиҳауп RC-LH116 аасҭа (3,6±0,1 е-RC-1 с-1).
Раԥхьаӡа ҳара иҳаԥхьаӡеит апротеин-W 10% ҟынӡа акомплекс хадаҿы ишыҟоу (16); Абраҟа, алашара маҷ, абжьаратәи алашара, алашара ду змоу рызҳаратә хәыцқәа рыҭара 15±0.6%, 11±1%, 0.9±0.5, еиқәыршәаны % (Асахьа 2F). Массатә спектрометриа аԥхьаӡаратә еиҿырԥшра иаанарԥшит, агистидинтә тег ацҵара абнатә хкы змоу аштаммқәа ирыҿырԥшны апротеин-W аизыҟазаашьатә рацәара шмырмаҷыз (Р = 0,59), убри аҟнытә абарҭ аҩаӡарақәа ԥсахыз апротеин-W артефактқәа ракәӡам (Асахьа S10). Аха RC-LH1 акомплекс аҿы апротеин-W амаҷра RC-қәак ирццакны рыҽрыԥсахра алнаршоит, уи абзоурала RC-LH116 акомплекс аҿы еиҳа иҵаӷоу хинон/хинолон аиҭныԥсахра еиҳа имаҷхоит. Ҳара игәаҳҭеит, алашара аанкылара аҩаӡара ҳарак аҵыхәтәантәи транскриптомикатә дыррақәа ишрықәымшәо, уи иаанарԥшуеит pufW гентә експресиа алашара ӷәӷәа аҵаҟа ишеизҳауа (Асахьа S11) (23). pufW транскрипциеи апротеин-W RC-LH1 акомплекс ахь алагалареи рыбжьара иҟоу аиԥшымра еилахәоуп, насгьы апротеин акомплекстә еиҿкаара аанарԥшыр алшоит.
RC-LH114-W аҿы 6 кардиолипин (CDL), 7 фосфатидилхолин (POPC), 1 фосфатидилглицерол (POPG) насгьы 29 β-DDM молекулақәа рзалхуп, насгьы уи аҿы 6 CDL, 24 POPC, 2 POPGs насгьы 1 рмодель ҟаҵоуп. RC-LH116 (Асахьа 5, А и В). Абарҭ аҩ-структурак рҿы, CDL еиҳарак акомплекс ацитоплазматә ган аҿы иҟоуп, POPC, POPG, β-DDM еиҳарак луминалтә ган аҿы иҟоуп. Ҩ-липидтәи аӡәӡәагатәи молекулақәа RC-LH114-W акомплекс αβ-1 инаркны αβ-6 рҟынӡа аҭыԥ аҿы иалкаан (Асахьа 5А), насгьы хәба RC-LH116 иеиҟароу аҭыԥ аҿы иалкаан (Асахьа 5В ). Акомплекс аҽа ганк аҿы еиҳаны алипидқәа рыԥшааит, еиҳарак CDL, RC еиԥш αβ-7 рыбжьара еизгаз αβ-13 рҟынӡа (Асахьа 5, А еиԥш В). Егьырҭ аструктурала иӡбау алипидқәеи аӡәӡәагақәеи LH1 ацәаҳәа анҭыҵ иҟоуп, насгьы ибзианы иӡбау ацилтә рҳәынҵәақәа LH1 асубединицақәа рыбжьара еиҵыҵуеит, RC-LH114-W аҿы β-DDM ҳәа иԥхьаӡоуп, RC аҿы β-DDM ҳәа иалкаауп А βPOPC16DM еилаԥсоуп. Ҳара ҳструктураҿы еиԥшу ахелаттә липидқәеи аӡәӡәагатә маҭәашьарқәеи рҭыԥқәа иаадырԥшуеит урҭ физиологиала акыр зҵазкуа аидҳәаларатә ҭыԥқәа шракәу (Асахьа S12A). Тч аҟны еиҟароу амолекулақәа рҭыԥқәагьы еиқәшәоит. Джентль и Трв. 970 RC-LH1s ашьаҭа (Асахьа S12, B инаркны E рҟынӡа) (9, 12) насгьы алипидтә хы агәыԥ ахидрогентә еидҳәаларатә ԥсыбаҩқәа рыхьчара бзианы иаадырԥшит ашьҭахьҟа аиқәыршәараҿы (Асахьа S13), уи иаанарԥшуеит, RC (24) иадҳәалоу еиқәырхаз CDL, абарҭ аҭыԥқәа рҿы еиқәырхазар ауеит.
(А и Б) RC-LH114-W (А) и RC-LH116 (В) апептидқәа ркарикатурақәа рыла иаарԥшуп, насгьы апигментқәа рцәаҳәақәа рыла иаарԥшуп, асахьа 1 аҿы иаагоу апшьы ахархәарала. RC QA и QB асаитқәа ирыдҳәалоу UQ еиқәаҵәоуп, еиҟәыҭханы иҟоу UQ еиқәаҵәоуп. (С и D) (А) и (В) рҿы иҟоу ахәаԥшышьақәа, алипидқәа рыцрыхны. (Е инаркны Г рҟынӡа) RC-LH116 аҟынтәи Q1(E), Q2(F) иара убас Q3(G) рҭеиҭыԥш ирҭбаау, еиныруа аганахьтәи ацәаҳәақәа рыла. Аӡыхьтә еидҳәалақәа ацәаҳәа еиқәаҵәақәа реиԥш иаарԥшуп.
RC-LH116 аҿы, RC QA, QB UQ, азарџь аиҟәыҭхаратә процесс аҿы аелеқтронқәа реиҭагара иалахәу, рыбжьаҵаратә ҭыԥқәа рҿы еилабгоит. Аха RC-LH114-W аҿы QB хинон ӡбаӡам, убри аҟнытә ҵаҟа еиҳа инарҭбааны ҳалацәажәоит. QA, QB хинонқәа рыдагьы, ҩ-хелаттә UQ молекулак (RC, LH1 ацәаҳәақәа рыбжьара иҟоу) RC-LH114-W структураҿы еихшоуп ибзианы иӡбау рхытә гәыԥқәа рыла (Q1, Q2 рҿы иҟоу). акосмос). Асахьа 5С). Ҩ-изопрентә еизакқәак рыҭоуп Q1, насгьы аҵарратә карта Q2 изопрентә мҵәыжәҩақәа 10 зегьы ӡбоит. RC-LH116 аструктураҿы х-хелаттәу UQ10 молекулак (Q1 инаркны Q3 рҟынӡа, асахьа 5D) ӡбахеит, насгьы амолекулақәа зегьы рҵыхәа зегьы аҿы еилыкка иҟоу аҭаҭынра рымоуп (асахьа 5, D инаркны G рҟынӡа). Аҩ-структурак рҿы, Q1, Q2 рхинонтә хытә гәыԥқәа рҭыԥқәа зеиԥшыҟам еиқәшәара рымоуп (Асахьа S12F), насгьы урҭ RC мацара ауп еидҳәалоу. Q1 RC-LH114-W W абжьаҟазара аҭаларҭаҿы иҟоуп (Асахьа 1G, 5, C, D, E), Q2 QB еидызкыло аҭыԥ азааигәара иҟоуп (Асахьа 5, C, D) F). Ихьчау L-Trp143, L-Trp269 рыԥсыбаҩқәа Q1, Q2 даара изааигәоуп, насгьы π-стакингтә еидҳәаларақәа рпотенциал рзаԥҵоит (Асахьа 5, Е, F, Асахьа S12). L-Gln88, 3.0 Å Q1 адистальтә оксиген аҟынтәи, иӷәӷәоу аҳаидрогентә еидҳәалара еиқәнаршәоит (Асахьа 5Е); абри аԥсыбаҩ еиқәырхоуп RCs зегьы рҿы еиҳа ихараны иҟоу аизыҟазаашьа ада (Асахьа S13). L-Ser91 консервативла Thr егьырҭ RCs рӷьырак рҿы иԥсахуеит (Асахьа S13), 3.8 Ангстром ауп Q1 аметилтә оксиген аҟынтә, насгьы иԥсыҽу аҳидрогентә еидҳәалақәа аиҭар алшоит (Асахьа 5E). Q3 ҷыдалатәи аидгылара амаӡамшәа убоит, аха RC-M субединица LH1-α субединица 5-6 рыбжьара иҟоу аӡы зцәымӷу аҭыԥ аҿы иҟоуп (Асахьа 5, D, G). Q1, Q2 и Q3 мамзаргьы ааигәа иҟоу ахелаттә хинонқәагьы Tch аҿы иӡбахеит. Аҟәымшәышә, Трв. Аштамм 970 и Blc. Ирис структура (9, 10, 12) RC-LH1 комплекс аҿы еиқәырханы иҟоу ацхыраагӡатә хинон еидызкыло аҭыԥ ахь иаанарԥшуеит (Асахьа S12G). RC-LH116 аҟны еилаԥсоу хә-UQ еиқәшәоит 5.8±0.7 еиуеиԥшым акомплексқәа рҟны, иҳараку аусуратә ӡыхьтә хроматографиа (HPLC) ала иалкаау, RC-LH114-W аҟны еилаԥсоу х-UQ еиҵоуп. аструкткра.
Псеудосимметриатә L, M полипептидқәа зегьы хә-ТМХк рымоуп, насгьы гетеродимер ҟарҵоит, уи еиднакылоит BChl димерк, ҩба BChl мономерқәа, ҩба бактериофаг (BPh) мономерк, насгьы Heme еиԥшым аиха, насгьы UQ10 молекулак-ҩбак. Аҵыхәтәантәи акетонтә гәыԥ аҿы аҳаидрогентә еидҳәалақәа рыҟазаареи, уи Rps аҿы еилкаау аизгареи рыла, акаротиноидқәа М-субединица иалаҵоуп, уи цис-3,4-дегидроорходопин ҳәа ахьӡуп. Ахкқәа (25). RC-H адәахьтәи амембранатә домен TMH заҵәык ала амембрана иадҳәалоуп. Иааизакны RC аилазаашьа еиԥшуп х-хәҭак RC еизыҟоу ахкқәа (Rba еиԥш). сфероидқәа (PDB ID: 3I4D). BChl и BPh рымакроциклқәа, акаротиноидтә ҟәаҟәа, насгьы агемтәым аиха еиқәыԥсоит абарҭ аструктурақәа рыӡбаратә диапазон аҿы, еиԥшҵәҟьа QA аҭыԥ аҿы UQ10 ахытә гәыԥи RC-LH116 аҿы иҟоу QB хинони (Асахьа S15).
Еиуеиԥшым QB ҭыԥқәа рҭакра аҩаӡара змоу ҩ-RC структурак рыҟазаара алшара ҿыц анаҭоит QB хинон аимадара иацныҟәо еиқәшәоу аконформациатә ԥсахрақәа рыҭҵаара. RC-LH116 акомплекс аҿы QB хинон инагӡаны иадҳәалоу “проксимальтәи” аҭыԥ аҿы иҟоуп (26), аха RC-LH114-W аилыхраҿы QB хинон ыҟаӡам. RC-LH114-W аҿы QB хинон ыҟаӡам, уи џьоушьартә иҟоуп, избан акәзар акомплекс активуп, RC-LH116 акомплекс структурала иӡбау QB хинон аасҭа еиҳа. Аҩ-LH1 ацәаҳәақәа ф-хинонк рҟынӡа хелат ҟарҵозаргьы, хәба структурала иӡбахоит иарку RC-LH116 ацәаҳәаҿы, хԥа мацара структурала иԥкуп иаарту RC-LH114-W ацәаҳәаҿы. Абри еизҳаз аструктуратә еилаҩашьара RC-LH114-W QB асаитқәа еиҳа ирласны рыԥсахра, акомплекс аҿы хинонтә кинетика еиҳа ирласны, LH1 ацәаҳәа ахысра алшара аизырҳара аанарԥшыр алшоит. Ҳара иҳаҳәоит, RC-LH114-W RC QB асаит аҿы UQ амамзаара еиҳа иуадаҩу, еиҳа активу акомплекс иалҵшәаны иҟазар шалшо, насгьы RC-LH114-W асаит QB иаразнак UQ аиҭныԥсахлараҿы иҵаахеит
QB ада, L-Phe217 иацныҟәо аҵәира UQ10 аимадара иақәымшәо аҭыԥ ахь, избан акәзар уи аҵыхәа актәи изопрентә еизак аҭыԥантәи аиҿагылара аанарԥшуеит (Асахьа 6А). Уи адагьы, еилкаау ихадоу аконформациатә ԥсахрақәа еилкаауп, ҷыдала аҳеликс де (аҳеликс кьаҿ TMH D и Е рыбжьара иҟоу ацәаҳәаҿы) уа L-Phe217 ииасуеит QB еидызкыло аџьыбахь, насгьы L-Tyr223 аикәарҳәра (Асахьа 6А ) Ахидрогентә еидҳәалара аԥыхразы QB еидызкыло афреим- асаит (Асахьа 6Б). Helix de pivots уи ашьаҭаҿы, L-Ser209 Cα 0.33Å еиҭасуеит, L-Val221Cα 3.52Å еиҭасуеит. ТМХ Д, Е рҿы иубарҭоу аԥсахрақәа ыҟаӡам, урҭ аҩ-структурак рҿы еиқәыԥсоуп (Асахьа 6А). Иахьынӡаҳдыруа, ари ԥсабаратә RC аҿы раԥхьатәи аструктура ауп, QB асаит зыркуа. Ихыркәшоу (QB-bound) аструктура аиҿырԥшра иаанарԥшуеит, ахинон еиҵахаанӡа, ахинон ахь анеиразы аконформациатә ԥсахра шаҭаху. L-Phe217 еикәарҳәуеит π-еиқәыршәаратә еидҳәалара аиҿкааразы хинонтә хытә гәыԥи иареи, насгьы аҳеликс адәахьы ииасуеит, L-Gly222 аҟәаҟәеи L-Tyr223 аганахьтәи аимхәыци агидрогентә еидҳәаларатә структура змоу аҳаидрогентә еидҳәаларатә ҳәаа ашьақәыргыларазы (Асахьа 6, А, С).
(А) Аголограмма (L рышьаҳага, апырпыл/М рышьаҳага, аԥштәы ҟаԥшь) рструктура еиқәыԥсоу амультфильм, уаҟа ихадоу аԥсыбаҩқәа кәадыр еиԥшу аарԥшра еиԥш иаарԥшуп. UQ10 аагоуп ашәҭ шьаҟала. Акәаԥқәа змоу ацәаҳәа иаанарԥшуеит аструктура зегьы аҿы ишьақәгылоу аҳаидрогентә еидҳәалақәа. (В и С) Аполипопротеин аҿықәтәи аарԥшра, насгьы ацәаҳәа аструктура зегьы, L-Phe217 аганахьтәи ацепочка ахәышәтәыга шьацԥшшәыла, L-Tyr223 ҟаԥшьла иалкааны. L асубединица апырпыл еиԥшуп; М и Н субединицақәа ԥштәыла иҟаӡам. (D и E) Аполипопротеин (D) и зегьы (E) RC QB асаитқәа [ԥштәы (A) ала] и Thermophilus thermophilus PSII (аҵәа, аиаҵәа пластиктә хинонла; PDB ID: 3WU2) Аиқәыршәара (58).
Ҳзықәымгәыӷӡоз ала, LH1 змам QB-дефициттә RCs рструктурақәа ԥыҭрак ыҟазаргьы, абри аҵараҿы иаҳбаз аконформациатә ԥсахрақәа ртәы уаанӡа иҳәамызт. Урҭ рахь иаҵанакуеит Blc аҟынтәи QB аԥсыҽхара аструктура. виридис (ПДБ ID: 3ПРЦ) (27), Тч. тепидум (ПДБ ID: 1ЕИС) (28) и Рба. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), урҭ зегьы рзеиԥш QB структура еиԥшуп ҳәа ҳҳәар ҳалшоит. 3PRC иааигәаны агәаҭара иаанарԥшит LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) аӡәӡәагатә молекулақәа QB аҭыԥ аҭаларҭаҿы ишеидҳәалоу, уи иарку аконформациахь аиҭеиҿкаара аԥырхагахар алшоит. LDAO 1EYS ма 1OGV рҿы еиԥшу аҭыԥ аҿы имԥхасҭамзаргьы, урҭ RCs еиԥшу аӡәӡәага ахархәарала иҟаҵоуп, убри аҟнытә еиԥшу аеффект рзаанагар рылшоит. Рба акристаллтә еиҿкаара. Сфаероидқәа RC цитохром c2 (PDB ID: 1L9B) еицкристаллизациа зызугьы иаркыз QB ҭыԥ рымоуп ҳәа угәы иаанагоит. Аха абри аҭагылазаашьаҿы RC-M полипептид N-терминалтә регион (Q helix аҿы иҟоу Tyr аԥсыбаҩ H еидҳәалала QB еидызкыло аҭыԥи иареи реидҳәалара) иԥсабаратәым аконформациа ааннакылоит, насгьы QB аконформациатә ԥсахра уаҳа иҭҵааӡам (30 ). Угәы шьҭызхуа, RC-LH114-W аструктураҿы М полипептид абас еиԥш иҟоу адеформациа ҳзымбацт, уи RC-LH116 RC N-терминалтә регион еиԥшуп ҳәа ҳҳәар ҳалшоит. Иара убас иазгәаҭатәуп, аӡәӡәага шьаҭас измоу LH1 антенна ақәгара ашьҭахь, PDB аҿы иҟоу аполипопротеинтә RCs рыӡбара мҩаԥысит, уи RC еиԥш иаакәыршаны иҟоу LH1 ацәаҳәа аҩныҵҟатәи ахыхьтәи аҩныҵҟатәи ахинонтә ӡҭаларҭақәеи алипидқәеи ықәнахуеит (31, 32). RC аусура иаанхоит, избан акәзар уи акофакторқәа зегьы ааннакылоит, еилаԥсо QB хинон ада, уи еиҳа имаҷны иҭышәынтәалоуп, насгьы лассы-лассы аҽазыҟаҵараан иӡуеит (33). Уи адагьы, идыруеит, LH1 RC аҟынтәи аԥсабаратә цикликтә липидқәа раныхра афункциақәа ишырныруа, еиԥш, азарџь-еиҟәыҭханы иҟоу P+QB-ҭагылазаашьа аԥсҭазаара аамҭа кьаҿра (31, 34, 35). Убри аҟнытә, ҳара ҳгәы иаанагоит, RC иаарыкәыршоу аҭыԥантәи LH1 ацәаҳәа аҟазаара “иарку” QB ҭыԥ еиқәнархар шалшо, убас ала QB азааигәара аҭыԥантәи аҭагылазаашьа ахьчара.
Аполипопротеин (QB хинон ада) аиҿартәышьа зегьы ҩ-ҭыхымҭак мацара ракәзаргьы, QB асаит аиҭныԥсахлара, еиуеиԥшым ахҭысқәа ракәымкәа, иҟоуп адыргақәа, аидҳәалара гидрохинонла еиҭа аидҳәалара аԥырҟәҟәааразы ашәқәа ҟаҵазар шалшо. Аполипопротеин QB аҭыԥ азааигәара хинололи хинони реидҳәалара еиԥшымзар ауеит, уи RC ала мап ацәкра ахь инагоит. Акыр ҵуеит аҳәара ҟаҵоуп, аконформациатә ԥсахрақәа ахинонқәа рыдҳәалареи рырмаҷреи рҿы ароль нарыгӡоит ҳәа. Ашьацәхныслара RCs рылшара ахинонқәа рырмаҷра ашьҭахь алашьцара адаптациа ԥсыҽхоит (36); Рентгентә кристаллографиа иаанарԥшуеит, абри ааха зыхҟьо QB хинонқәа активтә проксимальтә ҭыԥ аҟынтәи 4,5 Å ҟынӡа “дистальтә” конформациаҿы иахьҭаку (26) , 37). Ҳара иҳаҳәоит, ари адистальтә еидҳәаларатә конформациа аполипопротеини ацәаҳәа аструктура зегьы рыбжьара иҟоу абжьаратә ҭагылазаашьа асахьа ауп ҳәа, уи хинони раԥхьатәи аидҳәалареи QB асаит аартреи ирышьҭанеиуеит.
II RC тип, еиуеиԥшым афототрофтә бактериақәеи ацианобактериақәеи, аӡҟәаҿқәеи аҵиаақәеи ркомплекс аҿы иҟоу PSII аструктуратәи афункционалтәи аиқәырхара амоуп (38). Асахьа 6 (D, E) аҿы иаагоу аструктуратә еиқәыршәара PSII RCs еиԥшуп, насгьы абактериалтә RC комплекс QB аҭыԥ. Ари аиҿырԥшра акыр ҵуеит еизааигәоу хинонқәа рыдҳәалареи рырмаҷреи рсистемақәа рыҭҵаараҿы модельны иҟоу. Уаанӡатәи аҭыжьымҭақәа ирҳәон аконформациатә ԥсахрақәа PSII хинонқәа рылаҟәра ацуп ҳәа (39, 40). Убри аҟнытә, RC аеволиуциатә еиқәырхара ҳаназхәыцуа, ари уаанӡа игәаҭамыз аимадаратә механизм PSII RC QB ҭыԥ аҿгьы ахархәара амазар алшоит аксиген змоу афототрофтә ҵиаақәа рҿы.
Rps ΔpufW (немаркированный pufW делеции) и PufW-His (С-терминал 10х His-тегированный протеин-W выраженный из натурального pufW локуса) штаммов. palustris CGA009 ҳԥыхьатәи ҳусумҭаҿы ҳалацәажәеит (16). Абарҭ аштаммқәеи изогентә абнатә хкы змоу аҭаацәеи аҵааршәыга аҟынтәи ирыԥшааит хыԥхьаӡара маҷк ахәыцқәа PYE (5 г литр -1) (LB -80 °C аҟны иҵәахуп, 50% ( w/v) глицерол) апротеин, ацәаҵа ақәгара, насгьы сукцинат (% pla.]v) агар/w [15. Апластинка анаеробиатә ҭагылазаашьақәа рҿы ауада атемператураҿы ҵхыбжьон алашьцара иҭарҵон, нас OSRAM 116-W галогентә лампочкақәа (RS Components, UK) рыла еиқәыршәаз алашара шкәакәа (~50 мкмольм-2 с-1) ала ирлашон 3-5 мшы рыҩныҵҟа, колониак ҟалаанӡа. Зныктәи аколониа ахархәан 10 мл М22+ абжьаратәи (41) 0,1% (w/v) казаминоацидқәа (анаҩс М22 ҳәа иашьҭоуп) рыла еиқәыршәаны. Акультура 34°C атемператураҿы 180 rpm рыла 48 сааҭ рыҩныҵҟа ирҵысуа ахәышәтәыга лаҟә аҭагылазаашьаҿы еизҳауан, нас 70 мл акультура 24 сааҭ рыҩныҵҟа абри аҩыза аҭагылазаашьаҿы еиҵаҵан. мл зҵазкуа абжа-аеробтә культура рхы иадырхәоит 30 мл М22 амедиум 30 мл зҵазкуа универсалтә скрут-хыхьтәи иҵәцароу ашәырӡтә ԥыҭрак аҿы аинокуляциа азы, насгьы 48 сааҭ рыҩныҵҟа астерильтә магниттә мчыла еилаарцыруа (~50 мкмольм-2 с-1) иррадиациатәуп. Анаҩс 30 мл акультура 1 литр ҟынӡа акультура ала еиԥшҵәҟьа аҭагылазаашьақәа рҿы еиқәыршәан, нас уи 9 литр ҟынӡа акультура ~200 мкмоль-2 с-1 72 сааҭ рыҩныҵҟа ирлашо еиқәыршәан. Ахәыцқәа центрифугала 7132 RCF 30 минуҭ рыла еизган, ~10 мл 20 мМ трис-HCl (pH 8.0) рҿы еиҭаҵан, -20°C аҟны иҵәахын иаҭаххаанӡа.
Аӡыҭра ашьҭахь, еиҭа иҭаҵоу ​​ахәыцрақәа рҿы дезоксирибонуклеаза I (Мерк, Еиду Аҳәынҭқарра), лизоцим (Мерк, Еиду Аҳәынҭқарра) рыкристаллқәа ԥыҭрак, насгьы Роше ахолоензим протеаза ингибитортә таблеткақәа ҩба (Мерк, Еиду Аҳәынҭқарра) рыцҵатәуп. 20,000 psi ҳәа изышьҭоу афранцызтә қәыӷәӷәаратә кәалаԥ аҿы (Аминко, Америкатәи Ашәҭқәа) 8-12 раан акәаԥқәа ԥхасҭахеит. 18,500 RCF 15 минуҭк 4°C аҟны ацентрифуга амҩаԥгарала иԥымҽыз ахәҭақәеи имыӡӡо аԥхҭрақәеи анықәгаха ашьҭахь, 113,000 RCF аҟны 2 сааҭ 43,000°C аҟны ацентрифуга амҩаԥгарала апигменттә лизат аҟынтәи амембрана ҭаҭәан. Иҭәу афракциа ықәганы, ԥштәыла иҟоу амембран 100-200 мл 20 мМ трис-НСl (рН 8,0) аҿы еиҭа иҭаҵаны, иубаратәы иҟоу агрегатқәа ыҟамкәа иеиԥшны еиқәыршәатәуп. Иаку амембран 20 мМ трис-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) 2% (w/v) β-DDM злоу 1 сааҭ алашьцара аҿы 4°C аҟны ҟәымшәышәла еилаарцыруа иҭарҵон. Нас 70°C аҟны центрифугала 150,000 RCF 4°C аҟны сааҭк рыҩныҵҟа иӡааҵатәуп, иаанхаз имыӡуа амаҭәахәқәа раныхразы.
мл DEAE Sepharose ионтә еиҭныԥсахларатә колонка х-колонкак рыла (CV) еидызкыло буфер [20 мМ tris-HCl (pH 8.0) 0.03% (w / v) β-DDM злоу] ахь ахархәара аиоуит. Аколона ҩ-CV еидызкыло буферк рыла иӡәӡәатәуп, нас 50 мМ NaCl злоу ҩ-буферк рыла аколонна ӡәӡәатәуп. RC-LH116 комплекс 150-300 мМ NaCl линеартә градиентла 1.75 CV аҿы елуциа азуын, иаанхаз аимадаратә комплекс 0.5 CV аҿы 300 мМ NaCl злоу аимадаратә буфер ала елуциа азуын. 250-1000 нм рыбжьара абсорбциатә спектр еизганы, абсорбциатә еизыҟазаашьа (A880/A280) 1 еиҳаны 880-280 нм аҟны иаанкыланы, ҩынтә еидызкыло абуфер аҿы иӡааҵаны, еиҭа уи апроцедура ахархәарала DEAE аколонаҿы арыцқьараан. А880/А280 рацио 1,7 еиҳау, А880/А805 рацио 3,0 еиҳау афракциақәа рылаӡаатәуп, ахԥатәи араунд ионтә еиҭныԥсахлара мҩаԥгатәуп, насгьы А880/А280 рацио 2,2 еиҳау, А880/А805 рацио 0 еиҳау афракциақәа ныҟәгатәуп. Хәҭакла ирыцқьаз акомплекс ~2 мл рҟынӡа еизганы иҟан Амикон 100,000 молекуляртә хьанҭара аԥҵәара (МВКО) ацентрифугалтә фильтр (Мерк, Еиду Аҳәынҭқарра), насгьы Супердекс 200 16/600 ашәагаа змоу аҭыҵратә колонкаҿы иҭарҵеит (GE Healthcare, US) буфер 200 m thelume 1.5 КВ. Еизгатәуп абсорбциатә спектрқәа ашәагаа аҭыҵратә фракциа, насгьы еизгатәуп абсорбциатә спектрқәа А880/А280 рацио 2.4 еиҳаны, А880/А805 рацио 5.8 инаркны 100 А880 еиҳаны, насгьы иаразнак урҭ рхы иадырхәатәуп крио-ТЕМ аҭаӡ аиқәыршәаразы ма аҵәахразы -800 рҟынӡа.
PufW-His ашьаҭа аҟынтәи аӡыҭратә мембран 20 мл HisPrep FF Ni-NTA Sepharose колонка (20 мМ трис-HCl (рН 8.0) 200 мМ NaCl еиԥш 0.03% (w/w) злоу) IMcare буфер ( GE) аҿы иқәыргылан. v) β-ДДМ]. Аколонна IMAC буфер хә-CV рыла иӡәӡәан, нас 10 мМ гистидин злоу IMAC буфер хә-CV рыла. Акомплекс хада 100 мМ гистидин злоу хә-IMAC буферк рыла аколонна аҟынтәи иалхын. RC-LH114-W акомплекс злоу афракциа ~10 мл рҟынӡа еизгоуп еилаарцыруа аҭраҿы, Amicon 100,000 MWCO афильтр ала еиқәыршәоу (Merck, UK), 20 раан еидызкыло буферла иӡааҵан, нас 25 мл еилаҵаны DEAE Sephaur ахархәара азы, заанаҵ. Аколона ԥшь-КВ еидызкыло буферк рыла иӡәӡәатәуп, нас акомплекс аа-КВк рҿы 0-100 мМ NaCl рҟынӡа линеартә градиентла (еидызкыло абуфер аҿы), иаанхаз аԥшь-КВк рҿы 100 мМ еидызкыло буферк зҵазкуа Аинхаз акомплексқәа хлодиум еилаҵаны сотри8де0 2.4 еиҳау, насгьы А880/А805 аизыҟазаашьа 4.6 еиҳау афракциақәа ~2 мл рҟынӡа еизганы иҟан Амикон 100,000 MWCO центрифугалтә фильтр аҿы, насгьы 1.5 CV IMAC заанаҵ Буфер еиҟаратәыз Супердекс 200 16/60 1.5 КВ. Еизгатәуп абсорбциатә спектрқәа ашәагаа-алхратә фракциақәа рыла абсорбциатә спектрқәа рыла А880/А280 рацио 2.1 еиҳаны, А880/А805 рацио 4.6 инаркны 100 А880 еиҳаны, урҭ иаразнак рхы иадырхәоит ашьацҳәа ТЕМ аҭаӡ аиқәыршәаразы мамзаргьы -80 °C аҟынӡа иҵәахуп.
Атемпература лаҟә змоу ТЕМ-цехқәа рырхиаразы Leica EM GP иммерсионтә ҵааршәыга ахархәан. Акомплекс IMAC буфер аҿы 50-тәи А880 ахь ирӡааҵан, нас 5мкл ҿыц ицәырҵыз QUANTIFOIL 1.2/1.3 акарбонтә шьаҭа змоу аџьаз ҭаҭын (Agar Scientific, UK) ахь иҭарҵеит. 20°C 60% ацәаакыра 30 с рыла ацәаакыра иҭаҵаны, 3 с рыла ирҩаны, -176°C аҟны аӡытә етан аҿы ирцәоит.
RC-LH114-W акомплекс адыррақәа ҭаҩын eBIC (Електронтәи Биосахьаҭыхратә Центр) (Британиатәи Алмазтә Лашаратә Хыҵхырҭа) Титан Криос амикроскоп ала, уи аус ауеит 300кВ ирццакуа амчхарала, 130,000 енергиа Choose of-2× е Адыррақәа реизгаразы аԥхьаӡаратә режим аҿы асахьа ҭаҩразы ахархәара аиоуит Gatan 968 GIF Quantum K2 пик детектор змоу. Икалибртәу апиксель ашәагаа 1.048Å, насгьы адоза амҽхак 3.83 e-Å-2s-1. секунд рыла акино еизганы 40 хәҭаны еиҩишеит. Амикроскоп еиҭа ахшыҩзышьҭра аҭаразы акарбон ахьшьу аҭыԥ ахархәара, насгьы ҭыԥк аҿы х-фильмк еизгатәуп. Иааидкыланы 3130 фильм еизган, -1 -3мкм рыбжьара афокус ахаҭабзиарақәа рыла.
RC-LH116 акомплекс азы адыррақәа еизган абри амикроскоп ахархәарала Астербери Абиоструктуратә Лабораториаҿы (Лидстәи Ауниверситет, Великобританиа). Адыррақәа еизган аԥхьаӡаратә режим аҿы 130 к аизырҳарала, насгьы апиксель ашәагаа 1.065 Å ахь еиқәыршәан 4.6 е-Å-2s-1 адоза аманы. Акино 12 секунд рыла иҭаҩын, насгьы 48 хәҭаны еихшан. Иааидкыланы 3359 фильм еизган, рдефокус -1 -3мкм рыбжьара.
Адыррақәа зегьы рыусдулара мҩаԥысуеит Relion 3.0 амҩаҿы (42). Motioncorr 2 (43) ахархәарала ацәаҳәа аныҟәара ариашаразы дозатә шьаҭала, насгьы CTFFIND 4.1 (44) ахархәарала CTF (контрасттә еиҭагаратә функциа) апараметр еилкааразы. Абарҭ раԥхьатәи аусдура ашьҭахьтәи атиптә фотомикрографиақәа аарԥшуп асахьа 2 аҿы. S16. Автоматтә алхратә шаблон ҟаҵоуп 250-пиксельтәи афреим аҿы 1000-тәи ахәҭакқәа рҟынтә 250-тәи пиксель напыла иалхны, ҩ-дименсиатәи (2D) аклассификациа ҳәа акгьы ыҟамкәа, убас ала аҿырԥштәы аҟьашьра иақәшәо ​​мамзаргьы иубарҭоу аҟазшьақәа змам аклассификациақәа мап рыцәкны. Анаҩс, автоматтә алхра мҩаԥган амикрофотосахьақәа зегьы рҿы, RC-LH114-W 849,359 ҟәырҷахак, RC-LH116 акомплекс 476,547 ҟәырҷахак. Иалху ахәҭакәа зегьы ҩ-раундк ирхысит 2D аклассификациа, насгьы есыҽнытәи аҩра ашьҭахь, акарбонтә ҭыԥ иақәшәо ​​ахәҭакәа, аҿырԥштәы аҟьашьра, еилкаау аҷыдарақәа ыҟамзаргьы, мамзаргьы ӷәӷәала еиқәыԥсо ахәҭакәа мап рцәыркуеит, уи иахҟьаны 772,033 (90.9%) насгьы 359,6578 аклассификациа рхы иадырхәоит D RC-LH114-W и RC-LH116 соответственно. Раԥхьатәи 3D еиқәыршәаратә модель ҟаҵан стохастический градиентный спуск аметод ахархәарала. Аԥхьатәи амодель еиқәыршәагас ахархәарала, иалху ахәҭакәа 3D-ла ԥшь-категориак рыла еихшоуп. Ари акатегориаҿы иҟоу амодел еиқәыршәагас ахархәарала, иреиҳау акатегориаҿы иҟоу ахәҭакқәа рҿы 3D арыцқьара мҩаԥгатәуп, нас раԥхьатәи 15Å low-pass фильтр ахархәарала, ахәаахәҭратә ҭыԥ хҩаразы, 6 пиксель ԥшқа аҵкарқәа рыцҵара, насгьы апикселқәа рпроцесс ашьҭахь, Gatan K2 transfer funte of the top of transfer funte ариашаразы. RC-LH114-W данноқәа ргәыԥ азы, ари раԥхьатәи амодель ԥсахын, амаска аҵкарқәа рҿы иҟоу аҵарра ӷәӷәа аԥыхрала (UCSF Chimera аҿы акомплекстә ҵарра хада иацрыхны). Иалҵыз амоделқәа (RC-LH114-W, RC-LH116 рыӡбарақәа 3.91, 4.16 Å роуп) 3D аклассификациа аҩбатәи араунд азы еиқәыршәагас ахархәара роуеит. Ахархәара змоу ахәҭакәа раԥхьатәи 3D акласс аҿы еидгылоуп, насгьы аҭаацәара рыбжьара иӷәӷәоу акоррелиациа рымаӡам. Еилкаау аилазаашьатә ҷыдарақәа реиқәыԥсара ма рыҟамзаара. 3D аклассификациа аҩбатәи араунд ашьҭахь, еиҳа иҳараку аилкаара змоу акатегориа алхын [RC-LH114-W азы, категориак 377,703 ахәҭакәа (44.5%), RC-LH116 азы, ҩ-категориак ыҟоуп, зегьы еизакны 260,752 ахәҭакәа, W раԥхьатәи аикәарҳәра ашьҭахь, еиԥшымзаара маҷк аманы]. Иалху ахәҭакәа 400-пиксельтәи акәалаԥ аҿы даҽазнык иҭыргоит, насгьы 3D ацқьарала ирыцқьоит. Аӡҩыгатә маска ҟаҵоуп раԥхьатәи 15Å ҵаҟатәи аиасратә фильтр, 3 пиксельтә карта аҽырҭбаара, 3 пиксельтә маска ԥшқа рыла. Аҟәырҷахак азы CTF ариашара ахархәарала, ахәҭак азы аныҟәара ариашара, насгьы аҩбатәи араунд CTF ариашара, 3D арыцқьара, ахәаахәҭратә маскировка, насгьы ашьҭахьтәи аусдулара шьаҿацыԥхьаӡа имҩаԥысуеит, иалҵуа атекстура еиҳа ариашаразы. FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) 0.143 ҳәа аҵыхәтәантәи ахә ахархәарала, RC-LH114-W RC-LH116 рҵыхәтәантәи амодельқәа рыӡбарақәа 2.65, 2.80Å роуп. Аҵыхәтәантәи амодель FSC ахәы аарԥшуп асахьа 2. S17.
Апротеинқәа зегьы рышьҭанеирақәа зегьы еиҭагахоит УниПротКБ аҟынтәи: LH1-β (PufB; УниПрот ID: Q6N9L5); LH1-α (ПуфА; УниПротИД: Q6N9L4); RC-L (ПуфЛ; УниПрот ID: О83005); RC-M (ПуфМ; УниПрот ID: А0А4З7); RC-H (ПухА; УниПрот ID: А0А4З9); Апротеин-W (ПуфВ; УниПрот ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) ахархәара аиуит RC-L, RC-M, RC-H рыпротеинтә еишьҭагылақәеи Rba рыкристаллтә еиҿкаареи зҵоу RC ахьомологиатә модель аргыларазы. sphaeroides RC ахархәара аиоуит шаблонҵас (PDB ID: 5LSE) (46). Ухы иархәа “fit map” ҳәа изышьҭоу аинструмент UCSF Chimera аҟны, иҟаҵоу амодел ахсаала иақәшәарц (47), апротеин аилазаашьа аиӷьтәра, насгьы акофактор [4×BChl a (мономертә библиотека аԥсыбаҩ ахьӡ = BCL), 2×BPh a (BPH), акы-ҩба хкы UQ10 (U10), акы (ieFme) 3,4-дигидрогексакарбонилхолин (QAK)] ахархәара Coot (48) ацҵаразы. QAK мономертә библиотекаҿы иахьыҟам азы, уи PHENIX (49) аҿы иҟоу eLBOW амыруга ахархәарала параметризациа азуын.
Анаҩс, LH1 асубединица дыргылеит. Раԥхьаӡа PHENIX (49) аҿы иҟоу автоматтә аргыларатә мчы ахархәан, ахсаала ахархәарала, насгьы LH1-α, LH1-β апротеинтә еишьҭагылақәа ҭагаларас рхы иархәаны LH1 ашьҭанеира ахәҭак автоматла аргыларазы. Иалышәх иреиҳа инаӡоу LH1 субунит, иҭыжәганы Coot ахь иҭажәгал, напыла иацәыӡыз ашьҭанеира ацҵатәуп, насгьы ҩба BCls a (BCL) еиԥш спириллоксантин (CRT) ацҵараан аструктура зегьы напыла ирыцқьатәуп [иахәҭоу Rps инақәыршәаны LH1 акомплекс аҭацәра, насгьы еицырдыруа акаротен. Ахкқәа (17)]. LH1 субунит зегьы ақәҭыхра, насгьы UCSF Chimera “Docking Map Tool” ахархәара LH1 аҭацәра ааигәа иҟоу амодельтәым аҭыԥ аҿы ақәыргыларазы, насгьы Coot аҿы ариашара; еиҭах апроцесс еиҭаҟаҵатәуп LH1 субединицақәа зегьы рмодель ҟаҵахаанӡа. RC-LH114-W аструктуразы, Coot аҿы иалхым аҭаҭынра аҭгарала, апротеин USCF Chimera ахсаалаҿы иаанхаз апротеинтәым ахәҭақәа рҟынтәи еихшоуп, насгьы Autobuild амыруга ахархәара аиуеит раԥхьатәи амодель ашьақәыргыларазы, иаанхаз асубединицақәа (апротеин-W) Модельтәра. ФЕНИКС аҟны (49). Иацҵатәуп иҟам еишьҭагылақәа зегьы иалҵшәоу амодел ахь Coot (48), насгьы напыла ирыцқьатәуп асубединица зегьы. Иаанхаз еихшам аҭаҭынра алипидқәа реилаҵара иақәшәоит (PDB мономертә библиотека ID CDL = CDL, POPC = 6PL и POPG = PGT), β-DDM детергент (LMT) и UQ10 молекулақәа (U10). PHENIX оптимизациа (49) ахархәара, насгьы Coot (48) аҿы напыла оптимизациа, раԥхьатәи амодель зегьы аиӷьтәра азы, амодел астатистикеи аиқәшәара ахәаԥшратә хаҭабзиареи еиҳа аиӷьтәра залымшо аҟынӡа. Аҵыхәтәан, ахархәара LocScale (50) аҭыԥантәи ахсаала аҵарразы, насгьы егьырҭ ациклқәа ԥыҭрак анагӡара, иалхым аҭаҭынра амоделированиеи аавтоматтәи анапылатәи аоптимизациеи.
Иарбоу апептидқәа, акофакторқәа, егьырҭ алипидқәеи ахинонқәеи рыжәпара рыҩнуҵҟа иҭаҵоу ​​рсахьа 1, 2 рҿы иаарԥшуп. S18 инаркны S23 рҟынӡа. Аҵыхәтәантәи амодель астатистикатә дыррақәа аҭаӡҩыра S1 аҿы иаагоуп.
Даҽакала иарбамзар, УВ/Вис/НИР абсорбциа аспектрқәа еизган Cary60 спектрофотометр (Agilent, USA) аҿы 1 нм рыбжьара 250 нм инаркны 1000 нм рҟынӡа, насгьы аинтеграциа аамҭа 0.1s.
Аҿырԥштәы акварцтә киуветаҿы 2 мм амҩа змоу А880 1 ахь инеиуеит, насгьы 400-1000 нм рыбжьара абсорбциатә спектр еизгатәуп. Агьежьтә дихроиатә спектрқәа еизган Jasco 810 спектрополариметр (Jasco, Japan) аҿы 1 нм рыбжьара 400 нм инаркны 950 нм рҟынӡа 20 нм мин-1 ҳәа асканер амҽхак ала.
Молартә ӡра акоеффициент еилкаауп ацентртә комплекс 50 ҟынӡа А880 ахь аӡыршьрала. Аметанол зегьы рҿы иҟоу BChl 54.8 мМ-1 см-1 771 нм аҟны аӡра акоеффициент ала иԥхьаӡан, насгьы аӡра акоеффициент еилкаан (51). Ишәоу BChl аконцентрациа 32 (RC-LH114-W) мамзаргьы 36 (RC-LH116) рыла еиҩшатәуп, акомплекс хада аконцентрациа аилкааразы, уи анаҩс ахархәара аиуеит абуфер аҿы еизгоу абри аҿырԥшы абсорбциа аспектр аилкааразы Аӡра акоеффициент. еицтәараны. Хынтә еиҭакны ашәарақәа мҩаԥган ҿырԥштәыцыԥхьаӡа, насгьы аҳасабразы ахархәара аиоуит BChl Qy максимум абжьаратәи абсорбциа. 878 нм аҟны ишәоу RC-LH114-W аӡра акоеффициент 3280±140 мМ-1 см-1 ауп, 880 нм аҟны ишәоу RC-LH116 аӡра акоеффициент 3800±30 мМ-1 см-1 ауп.
UQ10 еилкаан (52) аҿы иаагоу аметод ала. Ажәакала, еиҭасуа афазатә ВЭЖХ (РП-ВЭЖХ) мҩаԥган Агилент 1200 ВЭЖХ асистема ахархәарала. 0.02 нмоль RC-LH116 мамзаргьы RC-LH114-W 50мкл 50:50 метанол:хлороформ 0.02% (w/v) аихатә хлорид злоу еилаҭәаны, заа иеиҟаратәу Beckman Coulter Ultrasolve m6 min-1 мм1 40°C HPLC ӡҩыга (80:20 метанол:2-пропанол) ×25 см ҵаҟа иҟоу аколонаҿы. 275 нм (UQ10), 450 нм (каротиноидқәа) 780 нм (BChl) рҿы сааҭк рыҩныҵҟа абсорбциа ахылаԥшразы HPLC ахәаҽыгаҿы изократтә елиуциа мҩаԥгатәуп. 275 нм хроматограммаҿы 25,5 минуҭ рзы иҟоу апик интегрирован, уи даҽа ԥшаара зылшо еилаҵақәак аҵамызт. Интегрированный область используется для вычисления молярного количества UQ10, извлеченного с отношением к калибровочной кривой, вычисленной от инъекции чистой стандартов 0 до 5,8 нмоль (Фигура S14). Аҿырԥштәы зегьы х-репликак рыла анализ рзуын, насгьы иҟаҵаз агха абжьаратәи SD иақәшәоит.
RC-LH1 комплекс зҵоу, 0,1 максимум Qy абсорбциа змоу ахәҭа 30 мкМ ирмаҷу аҽы агәы ацитохром c2 (Merck, UK) насгьы 0 инаркны 50 мкMUQ2 (Merck, UK) рыла еиқәыршәан. 1-мл х-сампалк рхиан UQ2 концентрациацыԥхьаӡа, насгьы 4°C атемператураҿы ҵхыбжьон алашьцара иҭарҵон, ашәара ҟалаанӡа алашьцара инагӡаны адаптациа аиурц азы. Аӡҩара OLIS RSM1000 модультә спектрофотометр ахь иҭарҵеит, уи 300 нм амцабз/500 ацәаҳәатә решетка, 1,24 мм аҭаларҭа, 0,12 мм агәҭантәи, 0,6 мм аҭыҵырҭатә ҭыԥқәа рыла еиқәыршәан. 600 нм ауадаҩрақәа змоу афильтр ацәырҵратә фототрубка аҭаларҭаҿы иқәыргылоуп, насгьы еиқәыршәаратә фотомультипликатортә трубка аҭаларҭаҿы, агәыҭҟьаратә лашара ацәыхьчаразы. Абсорбциа 550 нм аҟны ахылаԥшра мҩаԥган, интеграциатә аамҭа 0,15 с аманы. Агәыҭҟьаратә лашара 880 нм M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) аҟынтәи DC2200 контроллер (Thorlabs Ltd., UK) ала 90% интенсиврала фибер-оптикатә кабель ала иҭыҵуеит, насгьы алашара ахыҵхырҭахь90° акәакь аҿы иҭыҵуеит. Ашәагатә лашара асаркьа иаҿагылоуп, раԥхьаӡа аҿырԥштәы иамҭаз алашара архынҳәразы. абсорбциа ахылаԥшра 10 с 50 с алашара ҟалаанӡа. Анаҩс абсорбциа 60 с рыла алашьцара аҿы еиҭа ахылаԥшра мҩаԥган, хинолол еиҭах ацитохром c23 + шаҟа ирмаҷуа аилкааразы (иахәаԥш асахьа S8 амхәыцтә дыррақәа рзы).
Адыррақәа аус рыдулара мҩаԥган 0.5-10 с рыҩныҵҟа линеартә раԥхьатәи аԥсыҽра аиқәыршәарала (UQ2 аконцентрациа иабзоураны) насгьы UQ2 аконцентрациа зегьы рҿы х-сампалк рыбжьаратәи аԥсыҽрақәа рыԥхьаӡарала. RC-LH1 аконцентрациа, иарбанзаалак аӡра акоеффициент ала иԥхьаӡаз, ахархәара аиуит акаталитикатә еффективрахь аиагаразы, Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) аҿы иҭыхуп, насгьы Михаэлис-Ментен имодель иақәыршәоуп, иубарҭоу Км, Ккат рыхәқәа рышьақәыргыларазы.
Аамҭалатәи абсорбциа ашәарақәа рзы, RC-LH1 аҿырԥшы ~2μM IMAC буфер аҿы 50 мМ натриум аскорбат (Мерк, Америкатәи Ашәҭқәа) 0.4 мМ Тербутин (Мерк, Америкатәи Аидгылақәа) зҵазкуа иӡааҵан. Аскорбинтә ашьақар ԥсаҭатә електронтә донорҵас ахархәара амоуп, насгьы терт-бутаклофен QB ингибиторс ахархәара амоуп, ашәаратә процесс зегьы аҩнуҵҟа RC хада донор еиҵаны иаанхарц азы (даҽакала иуҳәозар, афотооксидтәымкәа). Иааизакны 3 мл аҿырԥшы ацҵахоит еиқәыршәоу еикәарҳәуа ацелл (0.1 м ҟынӡа адиаметр, 350 RPM) 2 мм оптикатә мҩа аура змоу, алазертә мҩаҿы иҟоу аҿырԥшы агәыҭҟьаратә импульсқәа рыбжьара алашьцаратә адаптациазы аамҭа амазарц азы. ~100-fs алазертә импульсқәа рхархәара Ti: Sapphire алазертә система (Spectra Physics, USA) амплификациа азы 880 нм аҟны 1 кГц ақәҭыхратә ҟазшьала (20 нДж NIR азы мамзаргьы 100 нДж Vis азы). Адыррақәа реизгара аламҭалазы, аҿырԥштәы 30 минуҭ рҟынӡа агәыҭҟьаратә лашара иҭажәгал. Аҽарҭбаара QA инактивациа ахылҿиаауеит (иҟалап QA знык-ҩынтәк армаҷра). Аха иазгәашәҭ, ари апроцесс еиҭарҵоит, избан акәзар, аамҭа рацәа анҵәамҭазы, RC ҳәаа змамкәа QA аусурахь ихынҳәуеит. Аспектрометр Helios (Ultrafast Systems, USA) ахархәан -10 инаркны 7000 ps рҟынӡа аамҭа змоу ииасуа аспектрқәа ршәаразы. Ухы иархәа Surface Xplorer апрограмматә еиқәыршәара (Ultrafast Systems, USA) данноқәа реизгақәа рыгәыԥқәа раԥыхразы, нас еидҵаны стандартизациа азутәуп. Ухы иархәа CarpetView апрограммтә пакет (Light Conversion Ltd., Lithuania) еилаҵоу адыррақәа реизга ахархәаразы, абжьысра иадҳәалоу адифференциалтә спектрқәа раиуразы, мамзаргьы ахархәара, еиуеиԥшым аекспонентқәа злоу афункциа, аинструмент аҭак аманы, OriginLa (USA) аҟны ацәқәырԥа заҵәыктәи аспектртә еволиуциа иақәшәарц азы.
Хыхь ишҳәаз еиԥш (53), RC еиԥш аперифериатә LH2 антеннақәа змам LH1 комплекс зҵоу афотосинтезтә фильм еиқәыршәан. Амембран 20 мМ трис (рН 8,0) иҭарҭәан, нас 2 мм оптикатә мҩа змоу акварцтә киуветаҿы иҭарҵеит. 30нДж лазертә импульс ахархәан 540 нм аҟны аҿырԥштәы агәыҭҟьаразы -10 инаркны 7000 пс рҟынӡа аамҭа аанкыланы. Аус адулара адыррақәа реизга Rps азы ишҳәоу еиԥш. pal аҿырԥштәы.
Амембран 150,000 RCF 2 сааҭ 4°C аҟны центрифугала еиқәыршәан, нас 880 нм аҟны уи абсорбциа 20 мМ трис-HCl (pH 8.0) 200 мМ NaCl рҿы еиҭаҵан. Амембран ҭаҭәаны 2% (w/v) β-DDM 4°C аҟны сааҭк алашьцара аҿы ҵаҟа-ҵаҟа еиланарҩынтуеит. Аҿырԥштәы 100 мМ триетиламмониум карбонат (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) 2.5 мг мл-1 апротеинтә концентрациа аҟынӡа иӡааҵан (Био-Рад анализ). Анаҩстәи аусдулара мҩаԥган уаанӡа икьыԥхьыз аметод ала (54), 50 мкг апротеин 50 мкл TEAB ахь 1% (w/v) натриум лаурат злоу аӡыҭра ала иалаганы. s рзы ультразвук ашьҭахь, уи 5 мМ трис (2-карбоксиетил) фосфин (Мерк, UK) 37°C 30 минуҭ рыла ирмаҷын. S-алкилирование азы, аҿырԥшы 10 мМ метил S-метилтиометансульфонат (Merck, UK) ацҵаны инкубациа азутәуп, насгьы 200 мМ изопропанолтә ҭаҭәа 10 минуҭ рыла ауада аҳауа атемператураҿы иацҵатәуп. Апротеолиттә рыцқьара мҩаԥган 2 мкг атрипсин/ендопротеиназа Lys-C еилаԥсаны (Promega UK) ацҵаны 37°C 3 сааҭ рыҩныҵҟа иҭарҵон. Лаураттә сурфактан 50 мл аетилацетати 10 мл 10% (v/v) LC градустә трифлуороцеттә ашьақар (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) ацҵаны 60 с рыҩныҵҟа аҵәҩанҵәыҟьарала иҭгахеит. Афазақәа реиҟәыҭхара 15,700 RCF 5 минуҭк рыҩныҵҟа ацентрифугациа ала еиҿкаан. Аҭыжьыҩ ипротокол инақәыршәаны, апептид злоу ҵаҟатәи афаза гәцаракрала аспирациеи аҵаа ацәгареи рзы ахархәара аиоуит С18 аспин-колонна (Thermo Fisher Scientific, UK). Вакуумтә центрифугала ирҩан ашьҭахь, аҿырԥштәы 0,5% ТФА, 3% ацетонитрил рҿы иӡааҵан, 500 нг анализ азыруит нанофлоу RP хроматографиала, масс-спектрометриеи еицны, ԥыҭрак ашьҭахь еиҭаҳәаз асистема апараметрқәа рыла.
Апротеин аидентификациеи аԥхьаӡареи рзы MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ахархәара Rps аԥшааразы. палустрис апротеомқәа рдырраҭара (www.унипрот.орг/протеомқәа/UP000001426). Амассатә спектрометриа апротеомикатә дыррақәа ProteomeXchange Альянс аҿы PRIDE апартнертә ҭаҵәахырҭа (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ала дыррақәа реизга аидентификатор PXD020402 ҵаҟа иҭарҵеит.
RPLC ала анализ азы, електроспрейтә ионизациатә массатә спектрометриа иацҵаны, RC-LH1 акомплекс еиқәыршәан абнатә хкы Rps рҟынтәи. Уаанӡа икьыԥхьыз аметод ахархәарала (16), palustris ахәыцрақәа рҿы иҟаҵоу апротеин аконцентрациа 20 мМ Hepes (pH 7.8), 100 мМ NaCl насгьы 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad анализ) ) DDM рҿы иҟан. Аҭыжьыҩ ипротокол инақәыршәаны, 2D арыцқьаратә еиқәыршәага (GE Healthcare, USA) ахархәарала 10 мкг апротеин аӡааҟәрыларатә метод ала аҭгара азы, насгьы аӡааҟәрылара 20 мкл 60% (v / v) форминтә ашьақар (FA), 20% (v / v) Ацетонитрил/vv (20% water) рҿы иӡааҵатәуп. Хә-микролитрк анализ рзуын РПЛК (Дионекс РСЛК) ала, уи амассатә спектрометриа (Maxis UHR-TOF, Bruker) иацҵаны. Употребляйте MabPac 1.2×100 мм колонку (Термо Фишер Саиентифик, UK) для разделения при 60°C и 100мклмин -1, с градиентом 85% (в/в) растворителя А [0.1% (в/в) FA и 0.02% (В/в/в) раствора B8/v [0.1%(v/v) FA и 0.02%(v/v) 90%(v/v) ацетонитрил TFA] 60 минуҭ инареиҳаны стандарттә електроспрей ионизациа ахыҵхырҭеи адефолттә параметрқәеи рыла, амассатә спектрометр 100 инаркны 2750 м/з (масса-зарядтә еизыҟазаашьа) аиура алнаршоит. ExPASy биоинформатикатә ресурстә портал FindPept аинструмент (https://web.expasy.org/findpept/) ацхыраарала, амассатә спектр акомплекс асубединицақәа рахь ахсаала ҟаҵатәуп.
Ахәыцқәа 72 сааҭ рыҩныҵҟа 100 мл NF-low (10мкМм-2 с-1), абжьаратәи (30мкМм-2 с-1) ма иҳараку (300мкМм-2 с-1) алашара ҵаҟа ирызҳауан. М22 амедиум (М22 амедиум, аммониумтә сульфат ахьыҟам, насгьы анатриумтә сукцинат анатриумтә ацетат ала иԥсахуеит) 100 мл зку аԥаҭлыкаҿы (23). 30-стәи хә-циклк рҿы 0,1 микронтәи ашәырӡтә хәырпыжәқәа 1:1 еизыҟазаашьала ирҭәын, ахәыцқәа рылизис азы, насгьы 5 минуҭк аҵаа иқәдырхьшәашәон. Имыӡӡо амаҭәашьарқәа, иԥымҽыз ахәыцқәа, ашәырӡтә хәырпыжәқәа 16,000 RCF 10 минуҭк рыҩныҵҟа ацентрифуга амҩаԥгарала рықәгара мҩаԥган. Амембран еиҟәыҭханы иҟан Ti 70.1 ротор аҿы 100,000 RCF 20 мМ трис-HCl (pH 8.0) 40/15% (w/w) сахароза градиент 10 сааҭ рыҩныҵҟа.
Ҳара ҳԥыхьатәи ҳусураҿы ишҳәаз еиԥш, PufW (16) аҿы His атег иммунодетекциа. Иааркьаҿны иуҳәозар, ирыцқьоу аҵакыратә комплекс (11,8 нМ) мамзаргьы RC еиԥшу аконцентрациа зҵоу амембран (оксидациала иалкаауп, еиҵоу аиԥшымра аспектр амхрала, насгьы ашәыга змоу агель аҿы иҟоу аидара аиқәшәарала) 2х SDS аҭагалара абуфер (Мерк, UK) ҩынтә еилаҭәаны. Апротеинқәа еиҟәыҭханы иҟан 12% бис-трис NuPage агель (Thermo Fisher Scientific, UK) ҳәа изышьҭоу арепликаҿы. Агель Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) ала ишәын, RC-L асубединица аҭагалареи аиҿырԥшреи рзы. Аҩбатәи агель аҿы иҟоу апротеин иммуноанализ азы аметанол-активациа зызу поливинилиденфлуорид (ПВДФ) амембранахь (Thermo Fisher Scientific, UK) ииагахеит. ПВДФ амембран 50 мМ трис-НСl (рН 7,6), 150 мМ NaCl, 0,2% (в/в) Твин-20 и 5% (в/в) аӡы ԥхасҭаҿы иаанкылан, нас анти-His антитело (буфер мН5р 7.6), 150 мМ NaCl и 0.05% (в/в) Твин-20] 1:1000 А190-114А, Бетил Лаборатории, США) 4 сааҭ рыҩныҵҟа. минуҭк антитело буфер аҿы 3 раан ианыӡәӡәаха ашьҭахь, амембран еидҵан хрен пероксидаза (Сигма-Олдрич, Еиду Аҳәынҭқарра) анти-мышь ҩбатәи антитело (1:10,000 антитело буфер аҿы иӡааҵаны) W инкубациа ҟаҵан (5 минуҭ рышьҭахь 3 раан антитело chemimine buffer CESTA0) (Сианаген, Италиа) иара убас Амершам Имаџьер 600 (GE Healthcare, UK).
Асахьаҭыхрала зегьы еиқәаҵәоу агель мамзаргьы иммуноанализтә мҩа, аҵыхәтәантәи аҭыԥ интеграциа азуны, RC-L (еиқәыршәоу агель) еиԥш Protein-W (иммуноанализ) рыинтенсивратә еизыҟазаашьа аԥхьаӡарала, ImageJ (57) аҿы Асахьа аус адулара. Ари аизыҟазаашьақәа молартә аизыҟазаашьақәа рахь ииаргеит, RC-L ацқьа RC-LH114-W аҿырԥштәы аҿы апротеин-W аизыҟазаашьа 1:1 ҳәа агәаанагара ҟаҵаны, насгьы уи инақәыршәаны адыррақәа зегьы рнормализациа ҟаҵаны.
Ари астатиа азы иацҵоу аматериалқәа рзы шәахәаԥш http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1.
Ари иаарту анеирҭатә статьоуп, Creative Commons Атрибуциа Алицензиа аԥҟарақәа рыла ирылаҵоуп. Астатиа азин анаҭоит ԥкрада ахархәара, аларҵәара, насгьы иарбанзаалак амедиум ала аиҭаҭыжьра, аха уи аоригиналтә усумҭа ииашаны иаагозар.
Агәынкылара: Ҳара шәара шәе-маил адрес шәҳәарц мацара ауп иҳаҳәо, адаҟьахь ишәыдышәкыло ауаҩы еиликаарц азы, е-маил ибарц шышәҭаху, насгьы уи спам шакәым. Ҳара е-маил адресқәак ҳҭакыӡом.
Ари азҵаара ахархәара амоуп уара уҭааҩу-уҭааҩу агәаҭаразы, насгьы автоматикала аспам ашьҭра аԥырҟәҟәааразы.
Девид Џь.К. Суинсбери, Парк Киан, Филипп Џь. Джексон, Кеитлин М. Фарис, Дариуш М. Нидзвицки, Елизабет С. Мартин, Девид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рансон, Даниел П. Каннифф , Марк Џь. Дикман, Деуи Хитер Холтен, Христос Џь.
Ареакциатә центр аҿы иҟоу алашаратә ҭыԥ 1 акомплекс аиҿкаара ҳарак ахинон адинамика аганахьала аилкаара ҿыцқәа ҳнаҭоит.
Девид Џь.К. Суинсбери, Парк Киан, Филипп Џь. Джексон, Кеитлин М. Фарис, Дариуш М. Нидзвицки, Елизабет С. Мартин, Девид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рансон, Даниел П. Каннифф , Марк Џь. Дикман, Деуи Хитер Холтен, Христос Џь.
Ареакциатә центр аҿы иҟоу алашаратә ҭыԥ 1 акомплекс аиҿкаара ҳарак ахинон адинамика аганахьала аилкаара ҿыцқәа ҳнаҭоит.
©2021 Аҭҵаарадырра аҿиаразы Америкатәи Ассоциациа. зегьы рзинқәа хьчоуп. АААС ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ХОРУС, КЛОКСС, КроссРеф, КАУНТЕР рпартниоруп. АҵарадырраАҿиарақәа ISSN 2375-2548.